Virus infeccioso en el aliento exhalado de casos de influenza estacional sintomática de una comunidad universitaria

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PNAS 30 de enero 2018 115 (5) 1081 a 1086; publicado por primera vez el 18 de enero de 2018; https://doi.org/10.1073/pnas.1716561115

  1. Editado por Peter Palese, Icahn School of Medicine en Mount Sinai, Nueva York, NY, y aprobado el 15 de diciembre de 2017 (recibido para revisión el 19 de septiembre de 2017)

Significado

La falta de datos humanos sobre la liberación de aerosoles del virus de la influenza alimenta el debate sobre la importancia de la transmisión aérea. Proporcionamos evidencia abrumadora de que los seres humanos generan aerosoles infecciosos y datos cuantitativos para mejorar los modelos matemáticos de transmisión y las intervenciones de salud pública. Demostramos que los estornudos son poco frecuentes y no son importantes para la aerosolización del virus de la influenza y que no es necesario toser. Nuestros hallazgos, que las infecciones de las vías respiratorias superiores e inferiores son independientes y que los aerosoles exhalados de partículas finas reflejan una infección en el pulmón, abrieron un camino para una comprensión más profunda de la biología humana de la infección y la transmisión de la influenza. Nuestra observación de una asociación entre la vacunación repetida y el aumento de la generación de aerosoles virales demostró el poder de nuestro método, pero necesita confirmación.

Abstracto

Se sabe poco sobre la cantidad y la infecciosidad del virus de la influenza que se libera al exhalar. Esto contribuye a la incertidumbre sobre la importancia de la transmisión de la influenza por vía aérea. Examinamos a 355 voluntarios sintomáticos con enfermedad respiratoria aguda y notificamos 142 casos con infección por influenza confirmada que proporcionaron 218 muestras pareadas nasofaríngeas (NP) y de aliento de 30 minutos (fracciones gruesas> 5 µm y finas ≤ 5 µm) en los días 1 a 3 después de la aparición de los síntomas. Evaluamos el número de copias de ARN viral para todas las muestras y cultivamos hisopos NP y aerosoles finos. Recuperamos virus infeccioso de 52 (39%) de los aerosoles finos y 150 (89%) de los hisopos NP con cultivos válidos. El número de copias de ARN de media geométrica fueron de 3.8 × 10 4 /30-minutos Fine-, 1,2 × 10 4 /30-minutos grueso aerosol muestra, y 8,2 × 108 por hisopo NP. El ARN viral de aerosol fino y grueso se asoció positivamente con el índice de masa corporal y el número de toses y se asoció negativamente con el aumento de días desde el inicio de los síntomas en modelos ajustados. El ARN viral en aerosol fino también se asoció positivamente con la vacunación contra la influenza tanto en la temporada actual como en la anterior. El ARN viral de hisopado NP se asoció positivamente con los síntomas de las vías respiratorias superiores y negativamente con la edad, pero no se asoció significativamente con el ARN viral de aerosol fino o grueso o sus predictores. Los estornudos eran raros y no eran necesarios estornudar y toser para la generación de aerosoles infecciosos. Nuestras observaciones sugieren que la infección por influenza en las vías respiratorias superiores e inferiores están compartimentadas e independientes.

La naturaleza de los contactos infecciosos y la importancia relativa del contacto, la pulverización de gotas grandes y la transmisión de aerosoles (núcleos de gotas) siguen siendo controvertidas ( 1 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ – 6 ). Se han empleado intervenciones no farmacéuticas para controlar y reducir el impacto de las epidemias y pandemias de influenza ( 7 ). Sin embargo, para diseñar intervenciones no farmacéuticas efectivas, es necesario definir con precisión la contribución relativa y absoluta de cada vía de transmisión ( 8 ) e implementar intervenciones que impidan las de mayor importancia.

Los modelos matemáticos que se han utilizado para comprender y estimar la contribución de cada modalidad son muy sensibles a estimaciones de parámetros no medidos ( 9 , 10 ), como la carga viral en el aliento espirado y la tos y la frecuencia de estornudos en los casos de influenza ( 8 ) . Sin embargo, debido a las limitaciones inherentes al muestreo de la diseminación del virus a través de varias rutas de los individuos infectados, y la dificultad de distinguir las rutas de transmisión en los estudios observacionales, la dinámica cuantitativa y las contribuciones relativas de cada ruta siguen siendo esquivas ( 4 , 8 ). Informes recientes han demostrado que el virus de la influenza infecciosa se puede recuperar de los aerosoles exhalados ( 11 ⇓ – 13). Estos estudios, basados ​​en un pequeño número de casos o maniobras de respiración artificial, no proporcionan datos suficientes para cuantificar el grado de liberación de aerosoles durante la respiración natural, ni identifican las contribuciones de toses y estornudos espontáneos que comúnmente se cree que son el mecanismo más importante para diseminación viral, o identificar otros factores que puedan afectar la diseminación viral de aerosoles. Abordamos estas brechas clave de conocimiento al caracterizar el virus de la influenza en el aliento exhalado de los casos de influenza adquirida en la comunidad durante la respiración natural, el habla provocada, la tos y los estornudos, y evaluamos la infectividad de los aerosoles de influenza que ocurren naturalmente.

Resultados

Examinamos a 355 voluntarios con enfermedad respiratoria aguda; los 178 voluntarios que cumplieron con los criterios de inscripción proporcionaron 278 visitas para la recolección de muestras. Confirmamos la infección por influenza en 156 (88%) de los participantes inscritos mediante qRT-PCR; 152 tenían al menos un hisopo nasofaríngeo (NP) positivo y 4 (3%) se confirmaron basándose únicamente en muestras positivas de aerosol. El análisis de frotis de NP fue positivo para 8 (33%) de 24 voluntarios seleccionados al azar de entre los 177 examinados que no cumplieron con los criterios de inscripción; por lo tanto, la sensibilidad y especificidad de nuestros criterios de inscripción, durante la temporada 2012-2013, fueron ∼73% [intervalo de confianza (IC) del 95% 62-84%] y 84% (IC 95% 80-88%), respectivamente. En los análisis informados, excluimos 8 visitas realizadas el día del inicio de los síntomas, 10 realizadas> 3 días después del inicio, 7 con datos faltantes de tos y 3 con datos de qRT-PCR incompletos (Fig. S1 y Tabla S1 ). El conjunto de datos resultante para casos confirmados con datos completos sobre copias de ARN, tos y síntomas incluyó 218 visitas por 142 casos: 89 casos de influenza A (83 H3, 3 pdmH1, 3 no subtipificables), 50 influenza B y 3 casos de infección de influenza dual.

La población de nuestro estudio ( Tabla 1 ) consistió principalmente en adultos jóvenes (19-21 años) con una alta prevalencia de asma (21%), índice de masa corporal normal (IMC, mediana = 22,7; 7% de peso insuficiente, 20% de sobrepeso y 8% de obesos) ( Tabla S2 ), y una baja tasa de vacunación contra la influenza autoinformada (22%). Observamos al menos una tos durante 195 (89%) y uno o más estornudos durante 11 (5%) de las 218 visitas. La frecuencia de la tos varió considerablemente, de 5 por 30 minutos en el percentil 25 a 39 por 30 minutos en el 75. La mayoría de los voluntarios calificaron sus síntomas respiratorios superiores como leves a moderados, los síntomas sistémicos como moderados a graves y los síntomas respiratorios inferiores como leves ( Fig. 1 ).

Tabla 1.

Características de la población de estudio

Figura 1.
Figura 1.

Histogramas de puntuaciones de síntomas. ( A ) Síntomas de las vías respiratorias superiores (secreción nasal, congestión nasal, estornudos, dolor de garganta y dolor de oído, rango de puntuación de 0 a 15). ( B ) Síntomas de las vías respiratorias inferiores (opresión en el pecho, dificultad para respirar y tos, rango de puntuación de 0 a 9). ( C ) Síntomas sistémicos (malestar, dolor de cabeza, dolor muscular / articular, fiebre / sudores / escalofríos e inflamación de los ganglios linfáticos, rango de puntuación de 0 a 15).

El virus infeccioso se recuperó de 52 (39%) muestras de aerosoles finos y 150 (89%) hisopos de NP ( Tabla 2 ). Los cultivos cuantitativos fueron positivos para el 30% de las muestras de aerosol fino, con una media geométrica (GM) para las muestras positivas de 37 unidades de foco fluorescente (FFU) por muestra de 30 minutos ( Fig.2 A ) y para el 62% de los hisopos NP con GM para muestras positivas de 2500. Usando el análisis de Tobit para ajustar la estimación del GM para la presencia de muestras por debajo del límite de detección, obtuvimos un GM 1.6 (95% CI 0.7-3.5) para aerosoles finos y un GM 60.6 (95% CI 22.7-1.6 × 10 2 ) para hisopos NP.

Tabla 2.

Diseminación viral

Figura 2.
Figura 2.

Exposición viral: ( A ) virus de la influenza infecciosa (recuentos de focos fluorescentes) en hisopos NP y aerosoles finos y ( B ) copias de ARN en hisopos NP, aerosoles gruesos y finos. ( C y D ) Gráficos de dispersión y coeficientes de correlación de Spearman de virus infecciosos representados frente a copias de ARN para ( C ) hisopos de NP y para ( D ) muestras de aerosoles finos. ( E ) El efecto del día después de la aparición de los síntomas en las copias de ARN observadas en hisopos de NP, aerosoles gruesos y finos representados como GM ajustado para los datos faltantes mediante el análisis de Tobit con barras de error que denotan IC del 95%. ( F – H ) El efecto de la frecuencia de la tos en las copias de ARN observado en ( F ) hisopos NP, ( G) aerosoles gruesos y ( H ) en aerosoles finos. Grueso: gotas de aerosol> 5 µm; Fino: gotas de aerosol ≤5 µm de diámetro aerodinámico.

Se detectó ARN del virus de la influenza en el 76% de las muestras de aerosoles finos, el 40% de las muestras de aerosoles gruesos y el 97% de los hisopos de NP de los voluntarios inscritos. Para las muestras positivas, el contenido de RNA viral GM de muestras fina de aerosol fue 3,8 × 10 4 , para los aerosoles gruesas fue 1,2 × 10 4 , y por hisopos NP fue 8,2 × 10 8 ( Fig. 2 B ). Los GM ajustados fueron 1,2 × 10 4 (IC del 95% 7,0 × 10 3 a 1,9 × 10 4 ) para aerosoles finos y 6,0 × 10 2 (IC del 95% 3,0 × 10 2 a 1,2 × 10 3 ) para aerosoles gruesos. El cultivo cuantitativo se correlacionó con las copias de ARN en ambos hisopos de NP ( Fig.2 C) ( r = 0,58) y aerosoles finos ( Fig. 2 D ) ( r = 0,34). El curso temporal de derramamiento se muestra en la Fig. 2 E .

El ARN viral en los hisopos de NP no se correlacionó con la frecuencia de la tos (número de toses por 30 min) ( Fig. 2 F y Fig. S2 A ) ( r = 0,02). El ARN viral en aerosoles gruesos se correlacionó débilmente con la frecuencia de la tos ( Fig. 2 G y Fig. S2 B ) ( r = 0,24). Sin embargo, el número de copias de ARN viral en aerosoles finos se correlacionó moderadamente bien con la frecuencia de la tos ( Fig.2 H y Fig. S2 C ) ( r= 0,45). Solo 3 (13%) de 23 muestras de aerosol grueso en las que no se observó tos tenían ARN viral detectable, mientras que 11 (48%) de las 23 muestras de aerosol fino correspondientes tenían ARN viral detectable y 8 fueron positivas por cultivo. Las copias de ARN en las muestras de aerosol fino sin tos variaron hasta 3,7 × 10 5 (GM ajustado 1,5 × 10 3 , IC del 95%: 4,2 × 10 2 a 5,3 × 10 3 ) y virus infecciosos a 1,4 × 10 2 FFU por Muestra de 30 min. Los pocos estornudos observados no se asociaron con un mayor número de copias de ARN en aerosoles gruesos o finos ( Fig. S3 ).

Los resultados de los análisis de regresión para identificar los predictores de la diseminación de ARN viral se muestran en la Tabla 3 , controlados por los efectos aleatorios del sujeto y las observaciones repetidas en los individuos.

Tabla 3.

Predictores de la diseminación de ARN viral

El día después del inicio de los síntomas (comparando el día 1 después del inicio con los días 2 y 3) se asoció con una disminución significativa en el ARN viral vertido en aerosoles finos ( P <0.05 para el día 2 y P <0.01 para el día 3 en modelos ajustados), un límite disminución significativa en la eliminación de aerosoles gruesos ( P <0,10), y no se asoció con un cambio significativo en la eliminación detectada en los hisopos NP ( P > 0,10).

En los análisis de regresión, la frecuencia de la tos se asoció significativamente con un aumento de la liberación de aerosoles finos ( P <0,001 a <0,0001) y gruesos ( P <0,01), pero no se asoció con la liberación de NP. El desprendimiento de aerosoles finos fue significativamente mayor en los hombres. El análisis de una interacción de la tos con el sexo indicó que los machos produjeron, en promedio, 3,2 veces más virus que las hembras por tos. Sin embargo, las mujeres también tosieron significativamente ( P = 0,005) con más frecuencia que los hombres: 33 (DE 39) por observación de 30 minutos y 21 (DE 21), respectivamente ( Fig. S4 ).

El IMC se asoció positivamente con la eliminación de aerosoles finos y gruesos en modelos no ajustados ( P <0,10). El IMC se mantuvo en los modelos ajustados de mejor ajuste para aerosoles finos y gruesos, donde se asoció significativamente con la dispersión de aerosoles finos ( P <0,05). Sin embargo, el IMC no se asoció con el desprendimiento detectado en los hisopos NP ( P > 0,10). Las categorías estándar de IMC no se ajustaron tan bien como el IMC continuo y no se asociaron significativamente con el desprendimiento ( Tabla S3 ), aunque es evidente una tendencia positiva para las personas con sobrepeso y obesidad en el modelo ajustado.

La vacunación autonotificada para la temporada actual se asoció con una tendencia ( P <0,10) hacia una mayor diseminación viral en muestras de aerosoles finos; Sin embargo, la vacunación con las vacunas estacionales del año actual y del año anterior se asoció significativamente con una mayor dispersión de aerosoles finos en los modelos ajustados y no ajustados ( P <0,01). En modelos ajustados, observamos 6,3 (IC del 95%: 1,9-21,5) veces más dispersión de aerosol entre los casos con vacunación en la temporada actual y anterior en comparación con los que no recibieron vacunación en esas dos temporadas. La vacunación no se asoció con el desprendimiento de aerosoles gruesos o NP ( P > 0,10). La asociación de vacunación y diseminación fue significativa para la influenza A ( P = 0.03) pero no para la influenza B ( P= 0,83) infecciones ( Tabla S4 ).

La carga viral en los hisopos de NP no fue un predictor significativo de la liberación de aerosoles ( P = 0,16 para aerosoles finos y P = 0,48 para aerosoles gruesos). La temperatura medida en el momento del muestreo, los antecedentes de asma, el tabaquismo y el tipo de influenza no se asociaron significativamente con la extensión de la diseminación medida. Si bien los síntomas autoinformados no se asociaron con el desprendimiento de aerosol, sí se asociaron significativamente con el desprendimiento medido por el hisopo NP; sólo los síntomas de las vías respiratorias superiores siguieron siendo significativos cuando se ajustaron a otros síntomas y la edad. El aumento de la edad se asoció con una disminución significativa en el desprendimiento en el hisopo NP; sin embargo, la edad no se asoció con la liberación de aerosoles.

Discusión

Recuperamos el virus de la influenza infecciosa de 52 muestras de aerosoles finos recolectados del aliento exhalado y toses espontáneas producidas por 142 casos de infección de influenza sintomática durante 218 visitas a la clínica. El hallazgo de virus infecciosos en el 39% de las muestras de aerosoles finos recolectadas durante 30 minutos de respiración de marea normal en un gran estudio comunitario de infección confirmada de influenza establece claramente que una fracción significativa de los casos de influenza arroja virus infeccioso de forma rutinaria, no simplemente ARN detectable, en partículas de aerosol lo suficientemente pequeñas como para permanecer suspendidas en el aire y presentan un riesgo de transmisión aérea. Debido a que estos datos se recopilaron sin que los voluntarios tuvieran que respirar a través de una boquilla o realizar toses forzadas, nos permiten proporcionar estimaciones de las tasas promedio de eliminación, variabilidad,

Las primeras estimaciones publicadas del número de variantes del virus de la influenza transmitidas del donante al huésped receptor indicaron que el cuello de botella para la transmisión entre humanos es bastante amplio y muy variable (media 192 con 95% de confianza 66–392) ( 14 , 15 ). Nuestra observación de que los casos liberan cantidades considerables de virus en aerosoles, GM> 10 4 copias de ARN por 30 min y hasta 10 3 partículas de virus infecciosos cada 30 min, sugiere que un gran número de variantes podrían transmitirse a través de aerosoles, especialmente a través del corto -modo de rango ( 16). Sin embargo, se esperaría que la transmisión de aerosoles de mayor alcance, como podría observarse en entornos menos concurridos que en el informe inicial de Hong Kong, generalmente resulte en exposiciones más bajas y transmisión de menos variantes, en consonancia con el cuello de botella más estrecho descrito en los modelos de hurón. ( 17 , 18 ).

Sobel Leonard y col. ( 14 ) sugirió que la amplitud del cuello de botella aumentaba con la gravedad de la enfermedad, como lo indica una asociación positiva significativa en el límite entre la temperatura y el número de variantes transmitidas. No vimos una asociación significativa entre la temperatura medida y el desprendimiento por ninguna vía. Por el contrario, los síntomas no fueron un predictor significativo del tamaño del cuello de botella y, en nuestros datos, los síntomas no fueron un predictor significativo de la diseminación en aerosoles. Los síntomas fueron, sin embargo, predictores significativos de desprendimiento nasal medido en hisopos de NP. Por lo tanto, si los aerosoles fueran la ruta de transmisión más importante, nuestras observaciones serían consistentes con el análisis de cuellos de botella actualmente disponible.

Observamos que los casos de influenza rara vez estornudaban, a pesar de haberse sometido a dos muestras de hisopos NP (un procedimiento que generalmente hace que uno sienta ganas de estornudar). No se observaron estornudos en ausencia de tos y no se asoció con una mayor liberación de aerosol que la que observamos con la tos sola ( Fig. S3 ). Por lo tanto, los estornudos no parecen hacer una contribución importante a la propagación del virus de la influenza en aerosoles. Los estornudos pueden contribuir a la contaminación de la superficie. Debido a que los estornudos generan cantidades considerables de rocío de gotas grandes compuesto por muchas gotas balísticas que nuestro muestreador no recolecta, no podemos evaluar esa posibilidad con nuestros datos.

La tos fue frecuente y fue un fuerte predictor de la diseminación del virus en aerosoles gruesos y finos. Sin embargo, la tos no fue necesaria para la generación de aerosoles infecciosos en la fracción de aerosol ≤5 µm (fina); detectamos virus cultivables en aerosoles finos durante el 48% de las sesiones de muestreo cuando no se observaron toses. Esto sugiere que las gotitas exhaladas, generadas por mecanismos distintos a la tos, son responsables de una parte de la carga viral observada en la fracción de aerosol fino. Varios investigadores han demostrado recientemente que las partículas de aerosol exhaladas se generan con frecuencia a partir de pulmones sanos normales mediante el cierre y la reapertura de las vías respiratorias pequeñas ( 19 ⇓ – 21). Se ha planteado la hipótesis de que durante las infecciones respiratorias, la frecuencia de cierre y reapertura de las vías respiratorias aumentaría debido a la inflamación con un aumento proporcional en la generación de aerosoles y la contagiosidad ( 22 ).

Se cree que la tos produce aerosoles de las grandes vías respiratorias por fuerzas de cizallamiento que producen gotitas de aerosol relativamente gruesas ( 23). Nuestro hallazgo de que solo el 13% de los casos en los que no se observó tos durante la recolección de la muestra produjo ARN viral detectable en sus aerosoles gruesos es consistente con esa hipótesis. Los aerosoles restantes pueden ser el resultado de hablar; cada sujeto debía recitar el alfabeto tres veces. Cabría esperar que la replicación viral en las grandes vías respiratorias, combinada con gotitas de aerosol grueso generadas por la tos, produjera la mayoría de los aerosoles virales. Sin embargo, observamos una correlación débil del número de copias de ARN de aerosol grueso con la frecuencia de la tos y una asociación mucho más fuerte del número de copias de aerosol fino con la frecuencia de la tos, aunque se esperaría que la tos fuera la fuente principal de aerosoles gruesos. Estas observaciones sugieren que la tos es, al menos en parte, un epifenómeno,

Un hallazgo sorprendente fue la asociación del género con la formación de aerosoles finos. Esta relación parece haber resultado de un impacto tres veces mayor de la tos sobre la muda en los hombres. Observamos estos efectos de interacción género y género por tos solo para la fracción de aerosol fino. La ausencia de un efecto de género en la fracción de aerosol grueso sugiere que esto no es un efecto de la tos sobre la generación de aerosol por fuerzas de cizallamiento en las vías respiratorias superiores. No medimos los volúmenes pulmonares y, por lo tanto, no podemos controlar el efecto del tamaño del pulmón. Una explicación igualmente plausible puede ser que las mujeres tienden a tener reflejos de tos más sensibles ( 24). Por lo tanto, las mujeres pueden haber tendido a toser en respuesta a cargas virales más bajas y a toser con mayor frecuencia con una carga viral determinada, lo que podría haber producido la pendiente más pronunciada observada de la carga viral en regresión en la frecuencia de la tos en los hombres en comparación con las mujeres. De acuerdo con esta sugerencia, observamos una frecuencia de tos significativamente mayor en las mujeres ( P = 0,005) y una pendiente más pronunciada de ARN viral en aerosol fino con tos en los hombres ( Fig. S4 ).

El IMC fue un predictor significativo limítrofe de la liberación de aerosoles en la mayoría de los modelos, se mantuvo como un predictor importante de aerosoles gruesos y finos en los modelos ajustados y alcanzó significación estadística para los aerosoles finos cuando se ajustó por otros factores; no fue un predictor significativo de muda nasal. Esta observación podría ser consistente con informes de aumento de la inflamación en modelos de obesidad e influenza y gravedad de enfermedades similares a la influenza en personas obesas ( 25 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ – 30). Alternativamente, el aumento del IMC se asocia con una mayor frecuencia de cierre de las vías respiratorias pequeñas, y el aumento resultante de la generación de aerosoles durante la reapertura de las vías respiratorias, como se describe anteriormente, puede explicar la asociación más fuerte del IMC con los aerosoles finos que los gruesos y la falta de asociación con los hisopos NP ( 31 ).

Nuestro análisis encontró una clara separación de los factores asociados con el derramamiento de la nariz y aquellos con derramamiento en aerosoles, especialmente aerosoles de partículas finas. Los síntomas de las vías respiratorias superiores, como era de esperar, estuvieron fuertemente asociados con el desprendimiento detectado en los hisopos de NP y redujeron en gran medida el tamaño y la importancia de los síntomas sistémicos y de las vías respiratorias inferiores en el modelo completamente ajustado. La edad se asoció negativamente con la diseminación nasal, pero no fue un factor predictivo de la diseminación de aerosoles. Más sorprendentemente, ningún síntoma, incluidos los sistemas respiratorio inferior y sistémico, estuvo fuertemente asociado con la diseminación en aerosoles, en esta población con síntomas respiratorios inferiores relativamente leves ( Fig.1). Además, la diseminación nasal no fue un predictor significativo de la diseminación de aerosoles y ninguno de los fuertes predictores de la diseminación de aerosoles se asoció con la diseminación nasal. Por lo tanto, podemos concluir que las vías respiratorias de la cabeza hicieron una contribución insignificante a la generación de aerosoles virales y que los aerosoles virales representan una infección en el pulmón. Además, la infección de las vías respiratorias superiores e inferiores parece comportarse como si la infección estuviera compartimentada e independiente. En este contexto, es notable que Varble et al. ( 18 ) observaron que las variantes virales intrahospitalarias difieren en la nasofaringe y el pulmón de los hurones.

No observamos una disminución significativa a lo largo del tiempo de la carga viral detectada en los hisopos de NP. Si el día 1 después del inicio de los síntomas (utilizado como línea de base para estos análisis) en nuestros casos fue equivalente a una mezcla del día 1 y el día 2 después de la inoculación experimental del virus de la influenza en el informe de Hayden et al. ( 32 ), entonces nuestra falta de encontrar una caída clara en la excreción nasal durante los próximos 2 días es razonablemente consistente con el patrón informado para la infección experimental. No hay datos disponibles para comparar la liberación de aerosoles de infecciones experimentales publicadas. El hecho de que viéramos un patrón mucho más claro de disminución rápida con el tiempo en la liberación de aerosoles sugiere nuevamente una separación de la infección en los compartimentos superior e inferior de las vías respiratorias en los seres humanos.

La asociación de la vacunación del año actual y del año anterior con una mayor diseminación de la influenza A podría llevar a especular que ciertos tipos de inmunidad previa promueven la inflamación pulmonar, el cierre de las vías respiratorias y la generación de aerosoles. Esta primera observación del fenómeno necesita confirmación. Si se confirma, esta observación, junto con la literatura reciente que sugiere una protección reducida con la vacunación anual, tendría implicaciones para las recomendaciones y políticas de vacunación contra la influenza.

Materiales y métodos

Procedimientos de recolección de muestras y población de estudio.

Reclutamos voluntarios con enfermedades respiratorias agudas en el campus de la Universidad de Maryland – College Park y la comunidad circundante desde diciembre de 2012 hasta marzo de 2013. La Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Maryland aprobó el estudio y obtuvimos un consentimiento firmado (o asentimiento y asentimiento verbal de los padres ) de voluntarios que informaron fiebre con tos o dolor de garganta ( Fig. S5 ).

Durante la visita inicial, administramos un breve cuestionario de detección, medimos la temperatura oral, la altura, el peso y recolectamos dos hisopos de NP (Copan) para cada voluntario examinado. Se utilizó un hisopo para realizar las pruebas rápidas QuickVue A / B para la influenza (excepto cuando estaban disponibles los resultados de una prueba rápida realizada por un proveedor médico). El segundo hisopo NP se utilizó para cultivo viral y PCR para aquellos que cumplieron con los criterios de inscripción y para PCR en una muestra aleatoria de 24 de los no inscritos.

Se preguntó a los participantes sobre el sexo, la edad, el uso de antipiréticos, el estado de vacunación, el uso de medicamentos esteroides, antecedentes médicos y de tabaquismo, para calificar los síntomas actuales en una escala de cuatro niveles (ninguno = 0, leve = 1, moderado = 2, grave = 3 ) y calificar los peores síntomas durante la enfermedad hasta el momento. Definimos los síntomas como respiratorio superior (secreción nasal, congestión nasal, estornudos, dolor de garganta y dolor de oído), respiratorio inferior (opresión en el pecho, dificultad para respirar y tos) y sistémicos (malestar, dolor de cabeza, dolor muscular / articular, fiebre / sudores / escalofríos e inflamación de los ganglios linfáticos).

Los voluntarios se inscribieron en la recolección de aire exhalado si cumplían con los siguientes criterios: ( i ) prueba rápida QuickVue positiva, o temperatura oral> 37,8 ° C más tos o dolor de garganta, y ( ii ) se presentaban dentro de los primeros 3 días del inicio de los síntomas. Las muestras de aliento exhalado se recolectaron utilizando el muestreador de bioaerosol de fuente humana Gesundheit-II (G-II), como se describió anteriormente ( 12 , 33). Recolectamos el aliento exhalado durante 30 minutos mientras el participante estaba sentado con la cara dentro del gran extremo abierto de una entrada en forma de cono para el G-II. El cono de entrada aspira 130 L de aire por minuto y permite a los participantes respirar, hablar, toser y estornudar de forma natural durante la recolección de la muestra mientras mantiene una eficiencia de recolección> 90% para las gotas exhaladas y tosidas ≤100 µm. Se pidió a los sujetos que respiraran normalmente y que recitaran el alfabeto una vez a los 5, 15 y 25 minutos. Recolectamos gotas de aerosol “gruesas” (> 5 µm) por impacto en una superficie de teflón y gotas “finas” (≤5 µm y> 0,05 µm) por crecimiento de condensación e impactación sobre una superficie de acero enjuagada constantemente en un tampón que contiene (PBS con 0.1% BSA) depósito de líquido.n = 59) o por reproducción de grabaciones digitales ( n = 159).

A los participantes inscritos antes del tercer día después de la aparición de los síntomas se les pidió que asistieran hasta dos visitas de seguimiento diarias consecutivas ( Fig. S5 ) con cuestionario repetido, hisopado NP y colecciones de aire exhalado. Los análisis finales incluyeron solo visitas para los casos inscritos que ocurrieron en los días 1 a 3 después de la aparición de los síntomas con datos completos sobre tos y estornudos, síntomas, resultados de PCR para muestras de hisopos y aerosoles.

Métodos de laboratorio.

Los métodos detallados se describen en Materiales y métodos SI . Brevemente, los hisopos de NP se eluyeron en 1 ml de PBS con BSA al 0,1% (PBS / BSA al 0,1%) o medio de transporte universal (Copan), y los impactadores de teflón se lavaron con un hisopo de nailon saturado con PBS / BSA al 0,1%. El hisopo se eluyó en 1 ml de PBS / BSA al 0,1%. Las muestras de aerosol fino se concentraron a 1 ml usando ultrafiltración centrífuga.

Se extrajo ARN de hisopos NP, muestras de aerosoles finos y gruesos, y estándares de virión completo utilizando un sistema Qiagen automatizado y el ARN viral se cuantificó mediante RT-PCR en tiempo real de un solo paso utilizando conjuntos de sondas de cebadores Taqman diseñados por los Centros de EE. UU. para el Control y la Prevención de Enfermedades y disponible a través de nuestro acuerdo de cooperación. Las curvas estándar se calibraron para el número de copias de virus usando plásmidos que contenían una copia de ADNc del amplicón diana de qRT-PCR. Los límites de detección y cuantificación determinados experimentalmente para cada una de las reacciones de qRT-PCR se muestran en la Tabla S5 .

Se utilizó un cultivo de virus en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) para detectar virus infecciosos en muestras de hisopos de NP y de aerosoles finos. Las muestras de aerosol grueso no se cultivaron para detectar virus infecciosos porque se esperaba que el impacto sobre una superficie seca de teflón redujera la infectividad de esas muestras. El virus de la influenza infecciosa se cuantificó usando un ensayo de inmunofluorescencia para la nucleoproteína de la influenza, y las células positivas se contaron como FFU por microscopía de fluorescencia. Los detalles de los métodos de laboratorio se pueden encontrar en Materiales y métodos SI .

Análisis estadístico.

Ingresamos y limpiamos datos utilizando herramientas de captura de datos REDCap alojadas localmente ( 34 ) y realizamos análisis y administración de datos en R (v3.2.3 R Development Core Team, Viena, Austria) y SAS (v9.4, Cary, NC), y produjo gráficos con el software Prism (software PRISM v7.0; GraphPad). Usamos el método delta para estimar los límites de confianza para la sensibilidad y la especificidad. Usamos correlación de Spearman, modelos lineales generalizados (SAS Proc GENMOD) y regresión Tobit ( 35) con efectos aleatorios anidados de la muestra dentro del sujeto en (SAS Proc NLMIXED) para analizar los recuentos de virus infecciosos, el número de copias de ARN y calcular las concentraciones de virus transgénicos. La regresión de Tobit tuvo en cuenta la incertidumbre y la censura de las observaciones por el límite de cuantificación. Incluimos todas las variables independientes con P no ajustado <0,10 en los modelos ajustados iniciales y modelos finales seleccionados utilizando el criterio de información de Akaike mientras se retuvo el ajuste por edad y sexo. Los resultados del modelo de regresión se presentan como el cociente entre el desprendimiento en el percentil 75 y el desprendimiento en el percentil 25 de la distribución de la variable independiente, de modo que el significado clínico y epidemiológico de la relación se pueda interpretar más fácilmente.

Expresiones de gratitud

Agradecemos a Chengsheng Jiang, Jing Zhang y Shuo Chen por las consultas de programación y estadísticas, y al resto de profesores, personal y asistentes de investigación de pregrado, enumerados en la Información de apoyo , que contribuyeron muchas horas para respaldar este estudio. Este trabajo fue financiado por el Acuerdo Cooperativo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades 1U01P000497 y por la subvención NIH 5RC1AI086900. Los hallazgos y conclusiones de este informe pertenecen a los autores y no representan necesariamente la posición oficial de la agencia financiadora.

Notas al pie

  • ↵ 1 Dirección actual: Departamento de Biología, Universidad Estatal del Oeste de Missouri, St. Joseph, MO 64507.

  • ↵ 2 Dirección actual: Center for the Built Environment, University of California, Berkeley, CA 94720.

  • ↵ 3 Dirección actual: División de Productos Virales, Centro de Evaluación e Investigación Biológica, Administración de Alimentos y Medicamentos, Silver Spring, MD 20903.

  • ↵ 4 Dirección actual: Davidson College of Engineering, San José State University, San José, CA 95192.

  • ↵ 5 A quién debe dirigirse la correspondencia. Correo electrónico: dmilton@umd.edu .

  • ↵ 6 Puede encontrar una lista completa del Consorcio EMIT en la Información de apoyo.

  • Contribuciones de los autores: investigación diseñada por SE, DKM y EC; JY, MG, JP, PJBdM, BA, FL, SE y DKM realizaron investigaciones; DKM aportó nuevos reactivos / herramientas analíticas; JY y DKM analizaron los datos; y JY, MG y DKM escribieron el artículo.

  • Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

  • Este artículo es una presentación directa de PNAS.

  • Este artículo contiene información de apoyo en línea en www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1716561115/-/DCSupplemental .

Este artículo de acceso abierto se distribuye bajo la licencia Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives License 4.0 (CC BY-NC-ND) .

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