La infección por coronavirus del SARS dependiente de anticuerpos está mediada por anticuerpos contra proteínas de pico (publicación de 2014)

Biochem Biophys Res Commun. 22 de agosto de 2014; 451 (2): 208–214.
Publicado en línea el 26 de julio de 2014. doi:  10.1016 / j.bbrc.2014.07.090
PMCID: PMC7092860
PMID: 25073113

Sheng-Fan Wang , a, b, Sung-Pin Tseng , Chia-Hung Yen , Jyh-Yuan Yang , Ching-Han Tsao , Chun-Wei Shen , Kuan-Hsuan Chen , Fu-Tong Liu , Wu-Tse Liu , Yi-Ming Arthur Chen , f, g,  y Jason C. Huang h, i, 

Datos asociados

Materiales complementarios

Abstracto

El coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) todavía tiene el potencial de resurgimiento, por lo que se están haciendo esfuerzos para crear una vacuna como estrategia profiláctica para el control y la prevención. La mejora dependiente de anticuerpos (ADE) es un mecanismo a través del cual los virus del dengue, los coronavirus felinos y los virus del VIH aprovechan las respuestas inmunitarias humorales antivirales para infectar las células diana del hospedador. Aquí describimos nuestras observaciones de SARS-CoV usando ADE para mejorar la infectividad de una línea celular de promonocitos humanos HL-CZ. Los resultados de tinción de inmunofluorescencia y PCR cuantitativa indican que el SARS-CoV es capaz de replicarse en células HL-CZ y de mostrar efectos citopáticos inducidos por virus y niveles elevados de TNF-α, IL-4 e IL-6 dos días después de la infección . Según los datos de citometría de flujo, las células HL-CZ también expresaron la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2, un receptor del SARS-CoV) y niveles más altos del receptor FcγRII. Encontramos que concentraciones más altas de antisueros contra el SARS-CoV neutralizaron la infección por el SARS-CoV, mientras que los antisueros altamente diluidos aumentaron significativamente la infección por el SARS-CoV e indujeron niveles más altos de apoptosis. Los resultados de los ensayos de infectividad indican que el SARS-CoV ADE está mediado principalmente por anticuerpos diluidos contra las proteínas de las espigas de la envoltura en lugar de las proteínas de la nucleocápside. También generamos anticuerpos monoclonales contra las proteínas de pico del SARS-CoV y observamos que la mayoría de ellos promovían la infección por el SARS-CoV. Combinados, nuestros resultados sugieren que los anticuerpos contra las proteínas pico del SARS-CoV pueden desencadenar efectos de ADE. Los datos plantean nuevas preguntas sobre una posible vacuna contra el SARS-CoV,

Palabras clave: Mejora dependiente de anticuerpos, Anticuerpo anti-pico, Receptores Fc, HL-CZ, SARS-CoV

1. Introducción

Los coronavirus son virus envueltos con genomas de ARN poliadenilados, encapsulados y de cadena positiva que varían entre 28 y 32 kb [1] . Los coronavirus causan enfermedades respiratorias y entéricas tanto en humanos como en animales domésticos; por ejemplo, se sabe que los coronavirus humanos 229E (HCoV-229E) y OC43 (HCoV-OC43) causan infecciones leves del tracto respiratorio superior. En 2003, se descubrió un nuevo coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) durante un brote de esa enfermedad [1] , que infectó a más de 8000 personas y mató a más de 700, y la mayoría de los casos identificados se produjeron en Asia [2] . Originalmente se asumió que el SARS-CoV se transmite a través de gotitas respiratorias o por contacto directo [3]. Sin embargo, algunos investigadores ahora sugieren que también se puede propagar a través del aire u otros procesos desconocidos [1] , [3] .

El genoma del SARS-CoV consta de 28 supuestos marcos de lectura abiertos (ORF) en 9 transcripciones de ARNm. ORF1a y ORF1b, que representan aproximadamente dos tercios del genoma, codifican poliproteínas grandes. El genoma codifica cuatro proteínas estructurales principales: pico (S), envoltura (E), membrana (M) y nucleocápside (N) [2] . Las glicoproteínas de pico de superficie viral inician la entrada del SARS-CoV en las células al unirse a los receptores de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), seguido de cambios conformacionales que dan como resultado la fusión de la membrana y la entrega del genoma al citoplasma [4].. La proteína SARS-CoV S es una proteína transmembrana de tipo I que consta de distintos dominios N-terminal (S1) y C-terminal (S2) que median respectivamente la unión del receptor y la fusión virus-célula. Las proteínas S son objetivos clave para generar anticuerpos neutralizantes protectores contra los coronavirus [2] , [5] . Las alteraciones menores en la proteína S pueden afectar el tejido, el tropismo de las especies y la virulencia del coronavirus. La función principal de una proteína nucleocápside es formar complejos de ribonucleoproteína helicoidales con ARN viral (ARNv) [6] . Además de comprender la estructura central del virión del SARS-CoV, estos complejos están involucrados en múltiples funciones como la transcripción, replicación y empaquetado de virus [2] , [6] .

Varias estrategias de vacuna en estudio se dirigen a genes o proteínas de espigas de SARS-CoV para inducir anticuerpos neutralizantes y protectores. Sin embargo, una preocupación importante es que las vacunas contra diferentes tipos de coronavirus tienen resultados marcadamente diferentes [7]; por ejemplo, los anticuerpos anti-spike ofrecen protección contra la hepatitis de ratón y la gastroenteritis transmisible, pero aumentan las infecciones por coronavirus felino (FCoV) [8] . Se ha observado un proceso de entrada de virus alternativo conocido como potenciación dependiente de anticuerpos (ADE) en virus como el dengue, la fiebre amarilla, el VIH y el FCoV, entre otros [7].. Aunque el mecanismo de ADE no se comprende completamente, generalmente se supone que el aumento de la producción de virus se debe a infecciones de un gran número de células susceptibles. Dichos aumentos están mediados por receptores de inmunoglobulina como Fc (FcR) o receptores del complemento que facilitan la captación de complejos virus-anticuerpo en los fagocitos, lo que resulta en un aumento de las infecciones de las células diana [7] . Sin embargo, no está claro si el SARS-CoV usa ADE para mejorar la infectividad.

Usamos aislados clínicos de SARS-CoV y virus pseudotipados para determinar si el ADE ocurre durante la infección por SARS-CoV. Nuestros experimentos involucraron una línea celular de promonocitos humanos, HL-CZ, que aún no ha sido reportada para infecciones por SARS-CoV. Según nuestros datos, las células HL-CZ expresan los receptores ACE2 y FcRII y pueden ser infectadas por el SARS-CoV. También notamos que los antisueros diluidos contra el SARS-CoV promueven la infección por el SARS-CoV, y que este fenómeno está mediado significativamente por anticuerpos anti-S. Finalmente, solo uno de varios anticuerpos monoclonales contra proteínas S generados para este proyecto expresó acción neutralizante; los otros mostraron efectos de ADE de leves a moderados en las células HL-CZ.

2. Materiales y métodos

2.1. Declaración de Ética

Se solicitó y recibió la aprobación para obtener sueros de pacientes con SARS-CoV del Comité de Ética Institucional de la Universidad Nacional Yang-Ming. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las reglas del comité.

2.2. Líneas celulares, virus y antisueros

Se utilizaron cinco líneas celulares: promonocito humano HL-CZ aislado de un paciente con leucemia [9] ; Riñón humano HEK293T; Riñón de mono verde africano Vero-E6; Raji B; y monocitos THP-1. El SARS-CoV (cepa TW1, número de acceso de GenBank AY291451 ) se obtuvo de los Centros para el Control de Enfermedades de Taiwán (CDC de Taiwán) [10] . Se generaron partículas de virus pseudo-tipificadas del SARS-CoV que llevaban la proteína S del SARS-CoV mediante la cotransfección de células HEK293T con pNL-Luc-ER- y pcDNA3-S [4] , [11] . Se recolectaron sueros anti-SARS CoV de pacientes infectados con SARS-CoV y se confirmaron en los laboratorios de los CDC de Taiwán.

2.3. Ensayos de infectividad y neutralización

Células HL-CZ o Vero-E6 (1 × 10 5 Se utilizaron / pocillo) en ensayos de infección directos. Se incubaron virus de SARS-CoV o pseudotipados (MOI = 0,1) con células durante 2 ha 37ºC en medio sin suero y se lavaron con PBS. Después de la incubación, se agregaron 2 ml de medio RPMI o DMEM que contenía suero al 10% y antibióticos 1X (100 UI de penicilina y 100 μg / ml de estreptomicina), seguido de otra incubación en CO 2 al 5% a 37 ° C durante diferentes períodos de tiempo. Los sobrenadantes virales y los lisados ​​de células infectadas se recogieron y se sometieron a análisis cuantitativos de RT-PCR dirigidos a la región ORFIb [12] . Las cantidades de partículas de SARS-CoV pseudotipadas se determinaron en términos de actividad luciferasa. Para los ensayos de neutralización, se agregaron células HL-CZ o Vero E6 a placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (5 × 104  células / pocillo). Se mezclaron virus pseudotipados del SARS-CoV (3.125 TCID 50 ) o del SARS-CoV (100 ng de p24) con varios mAb o sueros a diferentes diluciones y se incubaron a 37 ° C durante 2 h antes de agregarlos a células HL-CZ o Vero E6 . Los sobrenadantes de los cultivos se recogieron 2-4 días después de la infección; Las cargas virales se midieron mediante RT-PCR en tiempo real.

2.4. RT-PCR en tiempo real

El ARN viral se extrajo del sobrenadante del cultivo usando un Mini Kit de ARN Viral QIAamp (Qiagen). Los dos conjuntos de cebadores de RT-PCR en tiempo real utilizados para medir los ARNm fueron CDC-2 directo y inverso (nucleocápside; catálogo de los CDC de EE. UU. # KT0051) [11] y BNIoutS y BNIoutAS (ORF Ib) [12] .

2.5. Tinción por citometría de flujo e inmunofluorescencia

Las células se recolectaron y se mantuvieron durante 30 min a 4 ° C en PBS que contenía FBS al 1%, seguido de otros 30 min de incubación a 4 ° C con control de isotipo coincidente o anticuerpos monoclonales (1 μg / ml) para cada receptor de Fc humano indicado. . Los procedimientos de tinción por inmunofluorescencia se describen en [13] .

2.6. Preparación de proteínas SARS-CoV S y N

Se usó una cepa TW1 aislada de SARS-CoV de Taiwán (número de acceso de GenBank AY291451 ) como plantilla para clonar y amplificar genes de nucleocápside y espiga usando plásmidos expresados ​​en el sistema procariota. Los detalles y esquemas se describen en el archivo complementario; véanse especialmente S-Figs. 2 y 3 [3] , [11] .

2.7. Generación de anticuerpos monoclonales o policlonales contra las proteínas N y S del SARS-CoV

Nuestros procedimientos para generar anticuerpos monoclonales o policlonales son los mismos que los descritos en [14] . Brevemente, los ratones BALB / c se inmunizaron una vez y se les administraron dos refuerzos de 25 μg de proteínas recombinantes GST-spike (GST-SIa, -SIb y -SII) en 0,25 ml de PBS emulsionado con volúmenes iguales de adyuvante de Freund completo / incompleto (Sigma –Aldrich, St. Louis, MO). Se usaron ELISA y transferencias Western para confirmar los títulos de anticuerpos contra estas proteínas de fusión recombinantes antes de recolectar esplenocitos y fusionarlos con células de mieloma NS-1. También se utilizaron ELISA y transferencias Western para seleccionar los sobrenadantes de los cultivos de hibridomas en busca de la proteína de fusión GST-pico. Los clones que producen anticuerpos específicos se seleccionaron utilizando el método de dilución descrito en [15] .

2.8. Ensayos de apoptosis

Se realizaron ensayos de apoptosis de células HL-CZ usando tinción con Anexina V.

2.9. Inmunotransferencia

Se infectaron células HL-CZ o Vero-E6 con SARS-CoV y se incubaron a 37 ° C durante 48 a 72 h. Los sobrenadantes del cultivo se concentraron por ultracentrifugación a 25.000 rpm durante 2,5 hy se lisaron en tampón de muestra SDS-PAGE. La electroforesis SDS-PAGE se realizó de acuerdo con los protocolos dados en [11] , [14] .

2.10. Ensayos de mejora dependientes de anticuerpos

Los detalles del ensayo son los descritos anteriormente [5] , [16] , [17] . Los ensayos se realizaron utilizando sueros de pacientes normales y pacientes positivos al SARS-CoV. Se usaron anticuerpos policlonales de conejo o monoclonales de ratón contra proteínas S o N para evaluar ADE. Las células HL-CZ se infectaron con SARS-CoV o virus pseudotipados en presencia de control y anticuerpos anti-espiga o anti-nucleocápside (dilución de 10 a 2000 veces) y se incubaron a 37 ° C durante 48 h. Se recogieron los sobrenadantes y los lisados ​​celulares y se determinaron los títulos virales mediante RT-PCR cuantitativa o análisis de luminiscencia.

2.11. Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron un mínimo de tres veces. Se utilizó el software GraphPad Prism para todos los análisis estadísticos. La significación estadística ( p  <0,05) se calculó utilizando pruebas t de Student no apareado .

3. Resultados

3.1. Susceptibilidad de las células HL-CZ a la infección por SARS-CoV

Investigadores anteriores han infectado células de promonocitos humanos HL-CZ con los virus del VIH-1 y del dengue, entre otros [9] . Los resultados de nuestro ensayo de infectividad indican que HL-CZ puede infectarse con SARS-CoV (Figura 1 A). Según los datos cuantitativos de RT-PCR, se detectaron niveles más altos de expresión de ARNm de TNF-α, IL-4 e IL-6 en células HL-CZ 2 días después de la infección (Figura 1B). También se detectaron niveles traza de IL-3 e IL-1β (datos no mostrados). Las observaciones con microscopía óptica y tinción por inmunofluorescencia indican (a) un efecto citopático (CPE) 2 días después de la infección (Figura 1C) y (b) la presencia de SARS-CoV en células HL-CZ infectadas con SARS-CoV, detectadas por antisueros recolectados de pacientes positivos para SARS-CoV (Figura 1C). La producción infecciosa del virus del SARS-CoV en las células HL-CZ se confirmó mediante el uso de sobrenadantes de esas células para infectar las células Vero-E6, que se sabe que son susceptibles a los coronavirus. También observamos un CPE significativo en las células Vero-E6 los días 2 y 4 posteriores a la infección (Figura 1D).

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Las células HL-CZ son susceptibles a la infección por SARS-CoV. Después de infectar las células con SARS-CoV, se recogieron el sobrenadante del cultivo y los lisados ​​celulares para (A) detección de SARS-CoV y (B) expresión de ARNm de citocinas celulares. (C) Resultados de la observación del efecto citopático de HL-CZ y la tinción de inmunofluorescencia 2 días después de la infección. (D) Se utilizaron sobrenadantes de células HL-CZ simuladas e infectadas con SARS-CoV para infectar células Vero-E6 durante 2 d. Los resultados son de un experimento representativo de los tres realizados.

3.2. Las células HL-CZ expresan la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE 2) y receptores Fcγ, y muestran infectividad por SARS-CoV dependiente de anticuerpos

El ACE2 es un receptor funcional del SARS-CoV que abunda en las células epiteliales del pulmón y del intestino delgado [18] . Se ha demostrado que los receptores Fc (FcR) y los receptores del complemento [7] , que han sido identificados como alternativas para la entrada celular de ciertos virus, mejoran la infectividad dependiente de anticuerpos [7] , [17] . Nuestros resultados de citometría de flujo indican que las células HL-CZ expresaron tanto receptores ACE2 como niveles más altos de FcRII (CD32) (Figura 2 A).

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Las células HL-CZ expresan los receptores ACE2 y Fc y muestran una mejora dependiente de anticuerpos. (A) Resultados de análisis de citometría de flujo de receptores Fc y expresión de ACE2 en células HL-CZ. (B) SARS-CoV o infecciones simuladas en presencia de diversas diluciones de antisueros extraídos de pacientes con SARS-CoV. (C) Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de células HL-CZ infectadas con SARS-CoV en presencia de diversas diluciones de antisueros contra SARS-CoV. Las imágenes 1 y 3 indican diluciones de 10 y 2000 veces de antisueros contra SARS-CoV, respectivamente. La imagen 2 indica diluciones de 10 veces del tratamiento de control de sueros normales.

Intentamos determinar si esta mejora dependiente de anticuerpos también se produjo en células HL-CZ infectadas con SARS-CoV. Nuestros datos indican que el tratamiento con antisueros recolectados de pacientes con SARS-CoV y diluidos de 1000 a 2000 veces resultó en un aumento de la infectividad del virus y el CPE en comparación con el tratamiento con antisueros diluidos 10 veces (Figura 2B). Según las imágenes de microscopía electrónica de transmisión, se observaron cantidades más altas de partículas virales del SARS-CoV en las células HL-CZ tratadas con antisueros más diluidos contra el SARS-CoV (dilución de 2000 veces) (Fig.(Figura 2C-3)2C-3) en comparación con los tratados con antisueros menos diluidos (10 veces) (Fig. (Figura 2C-1)2C-1) y sueros de control normales menos diluidos (10 veces) (Figura 2C-2). Realizamos ensayos de infectividad adicionales para confirmar esta observación, y encontramos niveles significativamente más altos de infección por virus después del tratamiento con antisueros diluidos 100 y 1000 veces en comparación con los sueros de control de pacientes sin SARS-CoV en las mismas diluciones ( p  <0.05 ) (Fig. 3 A). También encontramos que los antisueros altamente diluidos contra el SARS-CoV aumentaron significativamente la apoptosis inducida por virus en las células HL-CZ en comparación con los sueros normales en las mismas diluciones ( p  <0.05) (Fig. 3B).

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La intensificación de la infección por SARS-CoV dependiente de anticuerpos está mediada por anticuerpos anti-proteína de pico. (A) Resultados de ensayos de infectividad utilizando células HL-CZ infectadas con SARS-CoV y tratadas con diversas diluciones de antisueros recogidos de pacientes con SARS-CoV. (B) Análisis de apoptosis de células HL-CZ infectadas con SARS-CoV en presencia de sueros normales diluidos 1000 veces y sueros anti-SARS-CoV (tinción con Anexina V). (C) Células HL-CZ infectadas con SARS-CoV en presencia de diversas diluciones (10, 100, 1000 o 2000 veces) de suero de proteína anti-espiga de ratón y suero de ratón de control de isotipo. (D) Células HL-CZ infectadas con SARS-CoV en presencia de diferentes diluciones (10, 100, 1000 o 2000 veces) de suero antinucleocápsido de ratón y suero de ratón de control de isotipo. C, sueros normales (control); S, sueros anti-SARS (muestra).∗ p  <0,05; ∗∗ p  <0,01).

3.3. La potenciación del SARS-CoV dependiente de anticuerpos está mediada por anticuerpos anti-spike

Nuestra siguiente tarea fue determinar qué anticuerpo promovía la infección por SARS-CoV. Observamos que los anticuerpos contra las proteínas S y N se producían en niveles altos durante las infecciones por SARS-CoV y, por lo tanto, usamos anticuerpos que reconocen las proteínas S y N para detectar infecciones tempranas del SARS-CoV. Después de generar anticuerpos de ratón contra proteínas recombinantes S y N ( Figs. Suplementarias 1-3 ), realizamos ensayos de infectividad usando diferentes sueros de ratón contra proteínas S o N en diferentes diluciones. Los resultados del ensayo indican que los sueros de ratón anti-S diluidos exhibieron efectos de ADE de SARS-CoV significativamente mayores en las células HL-CZ en comparación con los sueros de control de ratón diluidos ( p  <0,05) (Fig. 3C). Tenga en cuenta que los sueros de ratón anti-N diluidos no ejercieron ningún efecto ADE del SARS-CoV en las células HL-CZ (Fig. 3D).

Se generó una serie de anticuerpos monoclonales (mAb) contra proteínas de pico para confirmar este hallazgo ( Figuras suplementarias 1 y 3 ). Los epítopos de la proteína S reconocidos por los mAb se muestran enFigura 4 A. Como se muestra, solo SIb4 (epítopo 435 NYNWKR 440 en la región SIb) tenía capacidades neutralizantes. Otros anticuerpos monoclonales contra las proteínas S exhibieron efectos de mejora de leves a moderados en las partículas lentivirales que llevan un gen de luciferasa pseudotipado con proteínas de pico de la envoltura del SARS (Figura 4B). Los resultados del ensayo de infectividad también indican que el mAb SIb4 inhibió significativamente la infección por SARS-CoV de las células HL-CZ, mientras que SIb2 promovió la infección por virus en comparación con el control de isotipo. Según las observaciones de microscopía, SIb2 promovió un CPE significativamente más fuerte en comparación con SIb4 (que también mostró capacidad de neutralización) y el control isotípico (Figura 4D).

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Los anticuerpos monoclonales contra las regiones SIa de las proteínas de pico muestran una capacidad de potenciación dependiente de anticuerpos. (A) Mapeo de isotipo y epítopo de anticuerpos monoclonales contra proteínas de pico de SARS-CoV (NI  , no identificado; residuos de aminoácidos conservadores en negrita). Parte inferior, esquema de fragmentos de proteínas de espiga utilizadas para generar anticuerpos monoclonales. (B) Evaluaciones de los efectos de ADE de infecciones por virus pseudotipado del SARS-CoV de las células HL-CZ en presencia de los anticuerpos monoclonales enumerados en (A). (C) Los ensayos de infectividad se realizaron utilizando células HL-CZ infectadas con SARS-CoV tratadas con SIb4, SIb2 o anticuerpos de control de isotipo. (D) Efectos citopáticos observados en células HL-CZ tratadas con SIb4, SIb2 o anticuerpos de control de isotipo. Los resultados presentados son de un experimento representativo de tres realizados ( p  <0,05; ∗∗ p  <0,01).

4. Discusión

Si bien la generación de anticuerpos protectores contra proteínas específicas es una estrategia útil para el control de enfermedades microbianas, algunas respuestas inmunitarias a patógenos pueden tener efectos nocivos, por ejemplo, tormentas de citocinas asociadas con el virus de la influenza aviar y aumento de la mortalidad por infecciones por SARS-CoV. Se ha observado infección celular a través de la potenciación dependiente de anticuerpos para varias enfermedades virales, incluido el virus del dengue, el VIH-1 y el virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) [7] , [13] . En el presente estudio identificamos la susceptibilidad de una línea celular alternativa, HL-CZ, a la infección por SARS-CoV (Figura 1). Específicamente, encontramos que las células HL-CZ expresan receptores ACE2 y muestran un efecto citopático inducido por SARS-CoV. Dos equipos de investigación han informado de que ACE2 sirve como un receptor funcional para la infección por SARS-CoV, y que los monocitos periféricos y macrófagos humanos pueden ser infectados por SARS-CoV [19] , [20] . Nuestros resultados sugieren que HL-CZ puede servir como una línea celular alternativa para la investigación del SARS-CoV; específicamente, las células HL-CZ infectadas con el SARS-CoV mostraron un aumento en las secreciones de TNF-α, IL-4 e IL-6 (Figura 1B), pero solo trazas de IL-3 e IL-1β. Según los mismos dos estudios, los monocitos y macrófagos periféricos humanos pueden ser infectados por el SARS-CoV. Otro grupo de investigación observó la regulación positiva de IL-6 y TNF-α inducida por la proteína pico del SARS-CoV en macrófagos murinos, e identificó IL-6 e IL-8 como citocinas epiteliales clave inducidas por el SARS-CoV [21] . Combinados, estos datos sugieren que la IL-6 y el TNF-α inducidos por el SARS-CoV desempeñan un papel en la patogénesis del SARS, especialmente en términos de inflamación y fiebre alta.

Actualmente no existen vacunas autorizadas contra los coronavirus humanos. Para los animales, se han generado vacunas contra varios, incluido el virus de la gastroenteritis transmisible [22] . Sin embargo, los intentos de desarrollar una vacuna contra el coronavirus felino han fracasado debido al ADE [8] , que está mediado por receptores, sobre todo el receptor Fc gamma (FcγR), que facilita la captación del complejo antígeno-anticuerpo por las células diana. Nuestros datos indican que las células HL-CZ expresan niveles elevados de FcγRII. Según un informe, el FcγRII (CD32) desempeña un papel predominante en la mediación del SARS-CoV mediante el uso de anticuerpos contra diferentes tipos de FcγR en las células inmunitarias [17] . En ese estudio, las células THP-1, Raji y Daudi mostraron ADE durante la infección por SARS-CoV [17]. Encontramos que los receptores FcyRII y ACE2 se expresaron en células THP-1, Raji y HL-CZ ( Fig. 4 complementaria ). Combinados, estos hallazgos sugieren que FcyRII es importante para la mediación de ADE en algunos tipos de células inmunes durante la infección por SARS-CoV.

Algunos anticuerpos son capaces de aumentar la eficacia de la replicación del virus, ya sea aumentando la captación de complejos virus-anticuerpo infecciosos o aumentando la síntesis de proteínas virales y ácido nucleico [23] . Ha habido al menos un informe que indica que, en comparación con los virus no tratados, la replicación del VIH-1 se acelera cuando los virus se tratan previamente con anticuerpos contra el VIH-1 [24] . Según otro informe, se produjo una mayor tasa de infección por FIPV en macrófagos cuando estaban presentes anticuerpos anti-FIPV [25] .

Encontramos que concentraciones más altas de antisueros recolectados de pacientes infectados con SARS-CoV (dilución de 10 a 100 veces) mostraron una mayor capacidad de neutralización viral en comparación con concentraciones más diluidas (1000 a 2000 veces), lo que facilitó el SARS-CoV infección y niveles más altos inducidos de apoptosis inducida por virus (Fig. 3). Encontramos que este fenómeno ocurrió a través de ADE y fue mediado por anticuerpos anti-S, pero no por anticuerpos anti-N. Al menos dos estudios han demostrado que la infección por SARS-CoV induce cantidades abundantes de anticuerpos contra las proteínas S y N [2] , [6] . Las proteínas de pico, especialmente las que se encuentran en la región de unión de ACE-2 (318-510 aa), son capaces de producir anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV; Las proteínas de la nucleocápside inducen respuestas inmunitarias de los linfocitos T citotóxicos (CTL) que son específicamente protectoras contra el SARS-CoV [26] . Sin embargo, otro equipo de investigación ha sugerido que las vacunas de la subunidad SARS-CoV pueden inducir la neutralización y / o efectos parciales de ADE a través de las células del linaje B [16].. En un informe separado que describe resultados similares, los investigadores sugirieron que los anticuerpos anti-pico inducidos por la vacuna contra las proteínas S triméricas pueden mediar la ADE del virus pseudotipado del SARS-CoV en las células que expresan FcR [27] . Nuestros datos de anticuerpos monoclonales anti-pico indican que la mayoría de los que se encuentran contra las regiones SIa (1-460 aa) mostraron el efecto ADE en ambos pseudotipados de SARS-CoV (Figura 4B) y virus reales (Figura 4C), y que solo un anticuerpo monoclonal contra las regiones Slb (416-486 aa) mostró capacidad de neutralización viral. Los mecanismos asociados requieren una mayor investigación.

En este estudio, identificamos una línea celular susceptible alternativa, HL-CZ, para futuras investigaciones sobre el SARS-CoV, y descubrimos que el ADE asociado con la infección del SARS-CoV está mediado principalmente por anticuerpos anti-picos. Esperamos que esta información sea útil en el desarrollo de una vacuna humana contra el SARS-CoV, así como en la investigación que involucre infecciones inmunomediadas vinculadas a la patogénesis del SARS.

Expresiones de gratitud

Los autores desean agradecer a sus colegas del Centro de Investigación y Prevención del SIDA de la Universidad Nacional Yang-Ming y del Centro de Investigación de Enfermedades Infecciosas e Investigación del Cáncer de la Universidad Médica de Kaohsiung por su ayuda y útiles discusiones. Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Consejo Nacional de Ciencias de la República de China (NSC 101-2320-B-010-055-MY3).

Notas al pie

Apéndice A Los datos complementarios asociados con este artículo se pueden encontrar, en la versión en línea, en http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2014.07.090 .

Apéndice A. Datos complementarios

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Referencias

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