Resumen
Antecedentes
Métodos
Recomendaciones
Interpretación
Fondos
Introducción
La pandemia de COVID-19 ha dado nueva urgencia al examen de los mecanismos subyacentes que influyen en la propagación epidémica de los virus respiratorios. Un mecanismo propuesto es la interferencia viral, un fenómeno en el que la infección con un virus proporciona una protección transitoria contra la infección con otros virus relacionados o no relacionados.
En la última década, los avances en la detección de virus basada en el genoma han mejorado notablemente la capacidad de diagnosticar infecciones por virus respiratorios. A medida que estos métodos se generalizan, la acumulación de resultados de pruebas indica que la interferencia viral podría estar dando forma a las epidemias de virus respiratorios humanos. La atención se centró en esta idea durante la pandemia de 2009 de un virus de influenza A emergente (IAV), cuando los datos de varios países europeos indicaron que la epidemia anual de rinovirus de otoño interrumpió y retrasó la transmisión del virus de influenza emergente.
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Desde 2009, los análisis de co-detecciones de virus respiratorios comunes, incluidos rinovirus e IAV o rinovirus y virus sincitial respiratorio (RSV), han demostrado que las co-detecciones son significativamente más bajas de lo que cabría esperar por casualidad, lo que también apoya la hipótesis de interferencia viral. .
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Otra observación importante se realizó en un pequeño estudio de la vacuna contra la influenza intranasal viva atenuada, en el que los investigadores observaron una menor replicación de la cepa de la vacuna contra la influenza en niños que dieron positivo a otro virus respiratorio en el momento de la exposición a la vacuna.
En un modelo de ratón, la exposición previa a rinovirus atenuó la infección por IAV, con la salvedad de que el rinovirus no se replica en ratones.
El uso cada vez mayor de pruebas multiplex para virus respiratorios durante la última década, junto con los avances en el mantenimiento de registros médicos electrónicos y bioinformática, ofrece la oportunidad de comparar las tasas de detección conjunta de virus observadas y esperadas en una escala mucho mayor de lo que era posible anteriormente para evaluar más la evidencia de interferencia viral.
Investigación en contexto
Métodos
Diseño del estudio
El análisis de co-detección se realizó solo en muestras que se habían probado con el panel completo de PCR de virus respiratorio del Hospital de Yale-New Haven desarrollado en laboratorio para los siguientes diez virus: rinovirus; IAV; virus de la influenza B (IBV); RSV A y B; virus de la parainfluenza 1, 2 y 3; metaneumovirus humano; y adenovirus, como se describió anteriormente,
con cebadores de rinovirus actualizados en marzo de 2018
( apéndice p 4 ). Los resultados de las pruebas se obtuvieron del sistema de registro médico electrónico de Yale-New Haven Hospital Epic Systems utilizando un informe personalizado creado por el equipo de análisis de datos conjuntos de Yale y exportado a una hoja de cálculo de Microsoft Excel en una computadora cifrada. Los datos recuperados fueron: edad y sexo del paciente, fecha de la prueba, resultados de las pruebas para cada virus y plataforma de prueba. Se recuperó el número de historia clínica del paciente, pero se eliminó y se reemplazó por un número de muestra anónimo antes del análisis. Los datos se filtraron para incluir solo a adultos (≥ 21 años) y para excluir la repetición de pruebas en el mismo paciente dentro de la misma semana ( apéndice p 7 ).
Procedimientos
Para la infección, la superficie apical de cada cultivo primario de células epiteliales de las vías respiratorias humanas se lavó con 200 μL de solución salina tamponada con fosfato tibia (PBS; Sigma-Aldrich, Burlington, MA, EE. UU.), Luego los cultivos se inocularon con rinovirus 1A (HRV-01A; VR-481; Colección Americana de Cultivos Tipo [ATCC], Manassas, VA, EE. UU.) MOI 0 · 1 por pocillo en 200 μL de PBS con 0,1% de albúmina de suero bovino (AmericanBio, Natick, MA, EE. ºC, después de lo cual se eliminó el inóculo, se enjuagó la superficie apical con PBS y se reemplazó el medio basolateral con medio fresco. Las células se incubaron a 35 ° C durante 3, 24, 48 o 72 h para establecer la cinética de infección. Para el modelo de infección secuencial, El medio basolateral se suplementó con 150 μL de medio fresco el día 3 y se realizó una inoculación simulada o inoculación con IAV (MOI 0 · 1) con los mismos procedimientos que para el rinovirus 1A. Las células se inocularon con un IAV H1N1 descrito anteriormente que expresa un indicador de proteína verde fluorescente (GFP) durante la replicación (PR8-GFP), generosamente compartido por el Laboratorio García-Sastre (Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Nueva York, NY, EE. UU. ).
Evaluamos el efecto de la exposición previa a rinovirus sobre la respuesta del huésped y la replicación de IAV mediante PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) para ARNm de células huésped para ISG15, RSAD2 (Viperin), MX1 e IFITM3 el día 3 después de la infección por rinovirus, y RT-qPCR para ARN de IAV en los días 4 y 5 después de la infección por rinovirus (24 y 48 h después de la infección por IAV, respectivamente). También cuantificamos las células que expresan GFP usando microscopía de fluorescencia confocal en el día 4 después de la infección por rinovirus (24 h después de la infección por IAV).
Para probar formalmente si la exposición previa a rinovirus inhibe la replicación del IAV a través de la activación de la respuesta del interferón de la célula huésped, realizamos estudios secuenciales de infección en presencia de BX795 (Sigma Aldrich, Burlington, MA, EE. UU.), Un fármaco que bloquea la señalización inmune innata requerida para la respuesta al interferón.
Se añadió BX795 al medio basolateral 18 h antes de la inoculación con rinovirus a una concentración de 6 µM y se mantuvo a la misma concentración durante todo el experimento. Se recolectaron cultivos para el aislamiento de ARN y RT-qPCR para medir la inducción de ISG en el día 3 después de la infección por rinovirus, o se recolectaron el día 5 después de la infección por rinovirus (48 h después de la infección por IAV) para RT-qPCR para cuantificar rinovirus y virus de IAV ARN. Los detalles de RT-qPCR y microscopía de fluorescencia confocal se describen en el apéndice (págs. 2-3) . Los resultados mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
análisis estadístico
Papel de la fuente de financiación
Resultados
Entre el 1 de julio de 2016 y el 30 de junio de 2019, 8284 muestras respiratorias analizadas en el laboratorio de virología clínica del Hospital Yale-New Haven dieron positivo para rinovirus (n = 3821) o IAV (n = 4463) por todos los métodos de prueba, que incluyeron pruebas rápidas métodos de detección de influenza, detección directa de antígenos fluorescentes y PCR para un panel de virus respiratorios ( apéndice p 4 ). Observamos una estacionalidad consistente con otros estudios,
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con picos anchos de muestras positivas para rinovirus cada otoño y primavera, y un pico más estrecho de muestras positivas para IAV entre los picos de rinovirus cada invierno ( figura 1A ). El pico de cocirculación de rinovirus e influenza ocurrió del 1 de noviembre al 1 de marzo de cada año ( figura 1A). A continuación, nos centramos solo en las muestras analizadas con el panel completo de PCR del virus respiratorio del Hospital de Yale-New Haven durante los períodos de tiempo del 1 de noviembre al 1 de marzo, incluidos los datos de 2016-17, 2017-18 y 2018-19. Antes del filtrado, se disponía de 15 940 resultados de pruebas para el panel de PCR de virus respiratorios, y la mayoría de las pruebas se realizaban en adultos de 21 años o mayores (13 973 [87,7%]). Hubo aproximadamente el mismo número de detecciones de rinovirus e IAV en adultos y un ligero sesgo femenino tanto en el número de pruebas realizadas en general como en el número de pruebas positivas para rinovirus e IAV ( apéndice p 6 ). Después de filtrar para incluir solo a adultos (≥ 21 años) y eliminar las pruebas repetidas en un paciente determinado dentro de la misma semana, 13707 resultados estaban disponibles para el análisis de co-detección ( apéndice p 7). Los resultados de rinovirus e IAV que cumplieron con los criterios de inclusión reflejaron las tendencias estacionales en el conjunto de datos de muestra más grande, con una disminución de la incidencia de rinovirus y un aumento de IAV entre el 1 de noviembre y el 1 de marzo de cada año ( figura 1B ). En general, el número de muestras positivas para rinovirus e IAV después del filtrado fue aproximadamente igual, con 989 (7,2%) detecciones de rinovirus y 922 (6,7%) detecciones de IAV ( apéndice p 5 ).
El rinovirus y el IAV mostraron una tasa de co-ocurrencia significativamente más baja de lo esperado durante los meses de co-circulación máxima. El análisis de co-detección de los resultados de las pruebas que cumplen los criterios de inclusión reveló una asociación negativa significativa entre la detección de rinovirus y la detección de IAV, con un OR de 0 · 16 (IC del 95%: 0 · 09–0 · 28; tabla ). El número previsto de co-detecciones para rinovirus e IAV en ausencia de interacción fue de 67, pero solo se observaron 12 co-detecciones (χ 2 valor p = 1 · 08 × 10 −12). Además de nuestro análisis primario de rinovirus e IAV, los análisis secundarios que comparan las co-detecciones observadas y esperadas entre otros pares de virus utilizando resultados de pruebas que cumplen con los criterios de inclusión, basados en dos pruebas estadísticas diferentes, revelaron asociaciones negativas significativas entre rinovirus y RSV, metapneumovirus humano y IBV; entre IAV y RSV, metaneumovirus humano y virus parainfluenza; y entre RSV y metapneumovirus humano, y virus de parainfluenza, como se muestra en la tabla .
| Co-detecciones esperadas | Co-detecciones observadas | Odds ratio (IC del 95%) | valor p | |
|---|---|---|---|---|
| Rinovirus – IAV | 67 | 12 | 0 · 16 (0 · 09–0 · 28) | 1 · 08 × 10−12 |
| Rinovirus – RSV | 49 | 13 | 0 · 24 (0 · 14–0 · 42) | 5 · 25 × 10−8 |
| Rinovirus – hMPV | 21 | 7 | 0 · 31 (0 · 15–0 · 66) | 0 · 0020 |
| Rinovirus – PIV | 11 | 5 | 0 · 42 (0 · 17–1 · 01) | 0 · 066 |
| Rinovirus – IBV | 9 | 3 | 0 · 30 (0 · 10–0 · 96) | 0 · 047 |
| Rinovirus-adenovirus | 3 | 5 | 1 · 50 (0 · 59–3 · 79) | 0 · 39 |
| IAV – RSV | 46 | 10 | 0 · 20 (0 · 11–0 · 37) | 2 · 58 × 10−8 |
| IAV – hMPV | 20 | 3 | 0 · 14 (0 · 04–0 · 44) | 1 · 43 × 10−4 |
| IAV – PIV | 11 | 2 | 0 · 17 (0 · 04–0 · 71) | 0 · 0091 |
| IAV – IBV | 9 | 3 | 0 · 33 (0 · 10–1 · 03) | 0 · 067 |
| IAV-adenovirus | 3 | 3 | 0 · 92 (0 · 29–2 · 98) | 1 |
| RSV – hMPV | 15 | 1 | 0 · 06 (0 · 01–0 · 46) | 3 · 90 × 10−4 |
| RSV – PIV | 8 | 0 | 0 · 06 (0 · 004–0 · 95) | 6 · 41 × 10−3 |
| RSV – IBV | 6 | 1 | 0 · 15 (0 · 02–1 · 06) | 0 · 045 |
| RSV-adenovirus | 2 | 1 | 0 · 40 (0 · 06–2 · 93) | 0 · 73 |
| hMPV – PIV | 3 | 3 | 0 · 89 (0 · 28–2 · 79) | 1 · 0 |
| hMPV – IBV | 3 | 1 | 0 · 36 (0 · 05–2 · 57) | 0 · 53 |
| hMPV-adenovirus | 1 | 2 | 2 · 01 (0 · 49–8 · 33) | 0 · 27 |
| PIV – IBV | 1 | 0 | 0 · 32 (0 · 02–5 · 25) | 0 · 41 |
| PIV – AdV | 1 | 0 | 0 · 87 (0 · 05-14 · 21) | 1 · 0 |
| IBV-adenovirus | 0 | 1 | 2 · 25 (0 · 31–16 · 43) | 0 · 37 |
La infección de cultivos epiteliales diferenciados de las vías respiratorias humanas con HRV-01A (MOI 0 · 1) resultó en una replicación viral robusta durante las primeras 24-48 h, estabilizándose alrededor del día 3 después de la infección ( apéndice p 8 ). En este punto de tiempo, los cultivos infectados con rinovirus mostraron una inducción significativa de ARNm característicos de la respuesta de interferón antiviral, incluidos cuatro ISG que se ha demostrado que codifican efectores que bloquean la infección por IAV ( figura 2A , apéndice p 8 ).
Cultivos inoculados con rinovirus y luego infectados con un virus informador H1N1 IAV GFP descrito previamente (IAV PR8-GFP)
a los 3 días después de la infección por rinovirus mostró una inhibición significativa de la replicación de IAV, como lo indica una reducción de más de 15 veces en la carga viral de IAV por RT-qPCR tanto a las 24 h como a las 48 h después de la infección por IAV ( figura 2C ). Las imágenes de cultivos infectados con PR8-GFP con microscopía de fluorescencia confocal revelaron una reducción sorprendente en el número de células positivas para GFP en cultivos con infección previa por rinovirus ( figura 2D, 2E ; videos 1 , 2 ). Tomados en conjunto, estos hallazgos muestran que la infección por rinovirus induce una respuesta antiviral en el epitelio de las vías respiratorias humanas que persiste el día 3 después de la infección, y que la infección por rinovirus interfiere con la posterior infección por IAV.
Los cultivos epiteliales diferenciados de las vías respiratorias apoyaron la replicación robusta de la pandemia de IAV de 2009, H1N1pdm09, con títulos virales que se incrementaron más de 1000 veces después de la inoculación a una MOI de 0,1 ( apéndice p 8 ). Al igual que el rinovirus, IAV H1N1pdm09 indujo la expresión de ISG, aunque la magnitud de la inducción fue mucho menor que la observada durante la infección por rinovirus, con una ligera inducción a las 24 hy un aumento de las cantidades de transcripción de ISG 48 a 72 h después de la infección ( apéndice p 8 ). Estos datos sugirieron que en los primeros momentos, la inducción de ISG podría ser sustancialmente menor durante la infección por influenza sola en comparación con la infección por influenza más una infección previa por rinovirus. Para probar esta hipótesis, hicimos un experimento de infección secuencial, utilizando rinovirus seguido de H1N1pdm09 ( figura 3A). De acuerdo con los cursos de tiempo de la inducción de ISG durante cada infección individual, 24 h después de la infección por IAV, hubo una expresión significativamente mayor de transcripciones de ISG en cultivos preinfectados con rinovirus que en cultivos expuestos solo a IAV ( figura 3B ). Además, como se observa en la infección secuencial con rinovirus e IAV PR8-GFP ( figura 2 ), la infección previa con rinovirus condujo a una reducción significativa de la carga viral de IAV H1N1pdm09 en los días 4 y 6 después de la infección (24 y 72 h después de la infección por IAV; figura 3C ).
Como se muestra en la figura 4A , los cultivos epiteliales se preincubaron con o sin BX795, un fármaco que bloquea la señalización inmune innata requerida para la respuesta al interferón.
luego se simulan infectados o infectados con rinovirus y se incuban durante 3 días, seguido de infección con IAV H1N1pdm09. RT-qPCR para ARNm de ISG reveló que BX795 bloqueaba completamente la inducción de cuatro ISG que previamente se había demostrado que limitaban la replicación de IAV ( figura 4B ).
A continuación, los cultivos se infectaron con IAV H1N1pdm09 y se recogieron para el aislamiento y cuantificación del ARN viral mediante RT-qPCR el día 5 después de la infección. La cantidad de ARN de rinovirus durante la coinfección por rinovirus-IAV no fue significativamente diferente en presencia de BX795, aunque hubo una tendencia hacia cantidades más altas de rinovirus en presencia del fármaco ( figura 4C ). Por el contrario, el pretratamiento con BX795 tuvo un efecto marcado sobre la cantidad de ARN de IAV. De acuerdo con las observaciones de 24 hy 72 h después de la infección por IAV ( figura 3 ), hubo una reducción significativa de IAV en los pozos preinfectados con rinovirus, con una disminución de aproximadamente 50 000 veces en las cantidades de H1N1pdm09 en cultivos previamente infectados con rinovirus. en comparación con los pozos infectados con H1N1pdm09 solo ( figura 4D). Sin embargo, en los pocillos infectados con rinovirus que habían sido pretratados con BX795, la replicación de H1N1pdm09 se restauró en gran medida y no fue significativamente diferente a las cantidades en las células sin preinfección por rinovirus ( figura 4D ).
Discusión
Aquí, estudiamos el papel de los rinovirus en la mediación de la interferencia viral, un fenómeno en el que la infección con un virus altera la susceptibilidad del huésped a virus relacionados o no relacionados.
Nuestros resultados indican que una infección previa con rinovirus inhibe la infección con el virus de la influenza A activando las defensas antivirales en el tejido diana de ambos virus: el epitelio de las vías respiratorias humanas. El uso cada vez mayor de la detección basada en PCR durante la última década ha revelado una prevalencia inesperadamente alta de rinovirus en las vías respiratorias humanas, que antes no se apreciaba ya que las técnicas anteriores como el cultivo viral y la inmunotinción no detectan fácilmente el rinovirus.
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La capacidad para detectar la infección por rinovirus llevó a la observación de que la propagación del virus de la influenza pandémica H1N1 2009 en Europa pareció interrumpirse por la epidemia de rinovirus de otoño después del reingreso escolar, lo que plantea la cuestión de la interferencia entre estos dos virus y proporciona el impulso. para este estudio.
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Los resultados de nuestro análisis de datos clínicos contribuyen a acumular evidencia de interferencia entre rinovirus e IAV, que se basa en gran medida en la comparación de las tasas de detección conjunta de rinovirus y IAV observadas y esperadas en los pacientes. Examinamos una población de pacientes adultos durante tres temporadas de invierno en el área de CT y NY (EE. UU.) Cubiertos por el sistema de atención médica del Hospital Yale-New Haven. Aunque nuestro estudio se limitó a adultos de 21 años o más, las bajas tasas de detección conjunta que observamos para rinovirus e IAV en esta población son sorprendentemente similares a los resultados de diferentes poblaciones de pacientes, incluido un estudio de 2121 muestras pediátricas de la IAV H1N1 2009 pandemia en Francia; 1247 muestras de niños sintomáticos en Australia desde 2003; 33 652 muestras de pacientes de todas las edades en Australia mayores de 12 años;
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Nickbash y sus colegas también presentaron un modelo matemático que respalda aún más la interferencia viral.
Las similitudes en los resultados en diferentes geografías, poblaciones y diseños de estudios apoyan la idea de que las bajas tasas de detección conjunta de virus tienen una base biológica en lugar de representar un factor de confusión en un grupo de pacientes en particular. Aquí, presentamos una herramienta web para el análisis de detección conjunta y el intercambio de datos, para respaldar este tipo de análisis de más regiones geográficas y poblaciones.
Se han propuesto varios mecanismos para mediar la interferencia viral, incluido el bloqueo directo de los receptores de entrada viral para un virus por otro virus, la competencia viral por los recursos de la célula huésped y la inducción viral de respuestas inmunes innatas o adaptativas que protegen contra un virus relacionado o distinto.
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Los estudios que muestran que la infección con rinovirus y otros virus de ARN, incluso cuando son asintomáticos, pueden inducir la expresión de ISG en las vías respiratorias humanas centraron nuestra atención en la respuesta antiviral del interferón como posible mecanismo.
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Esta respuesta se inicia cuando los ácidos nucleicos virales son detectados por sensores inmunes innatos dentro de las células infectadas, lo que lleva a la producción de interferones de tipo I y III y a la inducción de ISG antivirales.
El interferón fue caracterizado por primera vez por Isaacs y Lindemann en 1957, en una serie de experimentos que demostraron que una sustancia producida por las membranas de los huevos expuestos al virus podría prevenir la infección por el virus de la influenza en huevos sin tratamiento previo.
y ahora se sabe que es un mecanismo de defensa eficaz contra muchos virus.
Es importante señalar que nuestro modelo experimental no captura todos los posibles mecanismos de interferencia in vivo. Los estudios en modelos animales han mostrado evidencia de inmunidad heteróloga, en la que la infección con un virus mejora la defensa inmune adaptativa contra otro.
Además, las infecciones secuenciales podrían inducir una inmunidad innata protectora cruzada a través de mecanismos adicionales. Un estudio en ratones mostró que las alteraciones en las respuestas inmunitarias innatas de la mucosa asociadas con las células que sobreviven a la infección por IAV podrían mediar la interferencia entre distintas cepas de influenza durante hasta 3 semanas.
Una forma de evaluar la importancia de la interferencia viral y sus mecanismos en las poblaciones humanas serán más estudios en humanos. Nuestro modelo predice que los individuos con defectos genéticos o adquiridos en las vías de señalización relacionadas con el interferón tendrán tasas más altas de coinfección viral junto con una expresión local deprimida de ISG en las vías respiratorias. Los estudios longitudinales de detección viral y respuesta del huésped de las vías respiratorias en humanos proporcionarán información sobre el papel de la respuesta al interferón en la susceptibilidad a infecciones virales secuenciales in vivo.
Finalmente, los resultados reportados aquí sugieren reevaluar la concepción actual de la infección por rinovirus. Se sabe desde hace mucho tiempo que el rinovirus es la causa más frecuente del resfriado común, pero el trabajo realizado durante la última década mostró que el rinovirus también está presente en tasas inesperadamente altas en personas asintomáticas y que incluso las infecciones asintomáticas pueden desencadenar la expresión de ISG en la mucosa de las vías respiratorias.
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Nuestros hallazgos sugieren que, aunque el rinovirus puede ser un patógeno, las infecciones por rinovirus también podrían funcionar en la protección del huésped al cambiar el punto de ajuste de la inmunidad innata epitelial y bloquear la infección por virus de mayor patogenicidad. De hecho, la epidemia anual de rinovirus otoñal asociada con el reingreso a la escuela en el hemisferio norte podría ser un factor importante que determina el momento y la gravedad de la epidemia anual de influenza invernal, una causa importante de morbilidad y mortalidad cada año. Junto con el trabajo anterior, los hallazgos presentados aquí indican que la interferencia viral debe considerarse en los esfuerzos por predecir y diseñar intervenciones para las epidemias de virus respiratorios, incluidas las epidemias anuales de influenza estacional y la pandemia de COVID-19 en curso.
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