Investigaciones exhaustivas revelaron alteraciones fisiopatológicas consistentes después de la vacunación con vacunas COVID-19

 

Abstracto

Actualmente, en muchos países se están llevando a cabo vacunaciones de COVID-19 a gran escala en respuesta a la pandemia de COVID-19. Aquí, informamos, además de la generación de anticuerpos neutralizantes, alteraciones consistentes en la hemoglobina A1c, niveles séricos de sodio y potasio, perfiles de coagulación y funciones renales en voluntarios sanos después de la vacunación con una vacuna inactivada contra el SARS-CoV-2. También se han informado cambios similares en pacientes con COVID-19, lo que sugiere que la vacunación imita una infección. La secuenciación de ARNm de una sola célula (scRNA-seq) de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) antes y 28 días después de la primera inoculación también reveló alteraciones consistentes en la expresión génica de muchos tipos de células inmunes diferentes. Reducción de CD8 +Las células T y el aumento del contenido de monocitos clásicos fueron ejemplares. Además, scRNA-seq reveló un aumento de la señalización de NF-κB y una reducción de las respuestas de interferón de tipo I, que se confirmaron mediante ensayos biológicos y también se informó que ocurrían después de la infección por SARS-CoV-2 con síntomas agravantes. En conjunto, nuestro estudio recomienda precaución adicional al vacunar a personas con afecciones clínicas preexistentes, que incluyen diabetes, desequilibrios electrolíticos, disfunción renal y trastornos de la coagulación.

Introducción

La pandemia de COVID-19 ha afectado profundamente a la humanidad. El desarrollo de vacunas COVID-19 en diversas formas se ha llevado a cabo de una manera acelerada y sin precedentes. A pesar de algunas incertidumbres con respecto a las posibles consecuencias, en muchos países se están llevando a cabo vacunaciones a gran escala. Se han desarrollado diferentes vacunas COVID-19, que incluyen partículas virales inactivadas, vacunas de ARNm, vacunas a base de adenovirus, etc. 1 , 2 , 3 , 4 , 5. Históricamente, la investigación de vacunas se ha centrado en si la vacunación podría generar anticuerpos neutralizantes para proteger contra infecciones virales, mientras que las influencias a corto y largo plazo de las diversas vacunas recientemente desarrolladas en la fisiopatología humana y otras perspectivas del sistema inmunológico humano no lo han hecho. ha sido completamente investigado.

Con el desarrollo de la tecnología de secuenciación de ARNm unicelular a gran escala (scRNA-seq), se hizo posible la investigación sistemática de la función del sistema inmunológico de las personas con precisión, principalmente a través de scRNA-seq de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Durante la pandemia de COVID-19, una gran cantidad de estudios que utilizaron scRNA-seq de PBMC habían revelado cambios detallados en la expresión génica en diferentes subtipos de células inmunitarias, incluidos diferentes tipos de células T y B, células NK, monocitos, células dendríticas, etc. durante y después de la infección, los resultados indicaron CD4 + y CD8 + muy reducidosNúmero de células T y agotamiento de las células T tras la infección por SARS-CoV-2. También se había observado un número reducido de células T invariables asociadas a la mucosa periférica (MAIT) y su migración dentro y fuera del pulmón. En pacientes con COVID-19 se habían informado respuestas inmunitarias inflamatorias altamente activadas, incluidas las respuestas de interferón-gamma (IFN-γ), interleucina-6 (IL-6) y NF-κB 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. Muchos estudios habían revelado diferencias en el estado inmunológico entre personas con síntomas graves y leves, en el sentido de que las fuertes respuestas de interferón tipo I (IFN-α / β) fueron beneficiosas después de la infección por COVID-19 y las respuestas atenuadas de IFN-α / β se asociaron con el desarrollo de síntomas severos 13 . Por el contrario, las respuestas inflamatorias de NF-κB más fuertes se asociaron con síntomas más graves [ 14] . Además, se informó que el aumento de las células γδ-T y la reducción del contenido de neutrófilos se asociaron con síntomas más leves 15 .

Tras las infecciones por SARS-CoV-2, muchas personas desarrollaron varios grados de síndromes respiratorios y algunas con afecciones gastrointestinales. Se había informado que los trastornos de la coagulación sanguínea, problemas vasculares, desequilibrios de electrolitos, trastornos renales, trastornos metabólicos, etc. eran complicaciones clínicas importantes con COVID-19 16 , 17 . No se ha evaluado completamente la forma en que la vacunación imitaría una infección. En este estudio, inscribimos a voluntarios sanos que iban a ser vacunados con una vacuna inactivada contra el SARS-CoV-2 (Vero Cell) 3, para participar en las pruebas de anticuerpos y anticuerpos neutralizantes, así como en las mediciones de laboratorio clínico detalladas antes y en diferentes momentos después de la vacunación (se aplicaron regímenes de dos dosis con esquemas ligeramente diferentes). Para nuestra sorpresa, observamos cambios fisiopatológicos bastante consistentes con respecto al contenido de electrolitos, los perfiles de coagulación, la función renal, así como las características relacionadas con el metabolismo de la glucosa y el colesterol, como si estas personas hubieran experimentado una infección por SARS-CoV-2. Además, los resultados de scRNA-seq de PBMC también indicaron reducciones consistentes en CD8 +Células T y aumentos en el contenido de monocitos, así como una señalización inflamatoria mejorada de NF-κB, que también imita las respuestas después de la infección. Sorprendentemente, las respuestas al interferón tipo I, que se habían relacionado con una reducción de los daños después de la infección por SARS-CoV-2 y síntomas más leves, parecieron reducirse después de la vacunación, al menos 28 días después de la primera inoculación. Esto podría sugerir que a corto plazo (1 mes) después de la vacunación, el sistema inmunológico de una persona se encuentra en un estado no privilegiado y puede requerir más protección.

Resultados

Seguimiento longitudinal de la producción de anticuerpos anti-SARS-CoV-2 y de anticuerpos neutralizantes después de la inoculación de la vacuna inactivada contra el SARS-CoV-2

En este estudio se inscribieron un total de 11 voluntarios adultos sanos de ambos sexos, de 24 a 47 años de edad, con un IMC de 21,5 a 30,0 kg / m² (figura 1a y tablas complementarias S1 y S2 ). La vacuna SARS-CoV-2 (Vero Cell), inactivada (Beijing Institute of Biological Products Co. Ltd), se administró por vía intramuscular en el deltoides. Los voluntarios se dividieron en dos cohortes; cinco participantes (cohorte A) fueron vacunados con una dosis completa (4 µg) de la vacuna inactivada contra el SARS-CoV-2 (Vero Cell) los días 1 y 14, y seis participantes (cohorte B) recibieron una dosis completa de la vacuna los días 1 y 28 (Fig. 1a). Uno de los voluntarios del grupo B dio positivo en la prueba de IgM e IgG anti-SARS-CoV-2 justo antes de la vacunación, lo que sugiere posibles infecciones previas. Sin embargo, no hubo registro de positividad previa por diagnóstico de ácido nucleico (NA) para COVID-19 (marcado en verde en la Fig. 1a ). Para todos los exámenes de seguimiento, los datos de esta persona se marcaron en verde para rastrear cualquier posible influencia de posibles infecciones previas.

Fig. 1: Flujo de trabajo esquemático y detección de anticuerpos anti-SARS-CoV-2 / anticuerpos neutralizantes después de la vacunación.
Figura 1

a Descripción esquemática de las estrategias de inoculación de vacunas, recolección de muestras de sangre y mediciones. b , c Cambios de positividad de anticuerpos (porcentaje positivo / total) a lo largo del tiempo en las cohortes A y B. Los voluntarios de la cohorte A se inocularon los días 1 y 14, y en la cohorte B, los días 1 y 28. La línea roja representa los cambios de IgM, y negro, IgG. d Cambios en el título de anticuerpos neutralizantes en el plasma de los voluntarios de las cohortes A y B después de la vacunación, así como de los individuos convalecientes analizados.

Los eventos adversos fueron monitoreados diariamente durante los primeros 7 días después de cada inoculación y luego los participantes los autograbaron en tarjetas de diario en las siguientes semanas. En general, las reacciones adversas fueron leves (grados 1 o 2) y transitorias (Tabla complementaria S3 ). Se recolectaron muestras de sangre los días 0, 7, 14, 28, 42, 56 y 90, y se recolectaron muestras de orina los días 0, 14, 28, 42 y 90. Las muestras de plasma se sometieron a tratamiento anti-SARS-CoV- 2 Pruebas de IgM / IgG utilizando varios kits de diagnóstico, los resultados del kit más sensible se utilizaron para la cuantificación (Fig. 1b, c). Los resultados de las pruebas de la cohorte A demostraron que antes de la segunda inoculación, el 0% de los participantes desarrollaron IgG anti-SARS-CoV-2, pero para el día 28, que fue 2 semanas después de la segunda inoculación, el 100% de los participantes dieron positivo ( Figura 1b ). En general, la IgM apareció antes que la IgG, lo que se esperaba. La positividad de IgG e IgM disminuyó el día 42 y permaneció en niveles relativamente bajos el día 90 en la cohorte A. Para la cohorte B, nadie desarrolló IgG hasta después de la segunda inoculación. Sin embargo, para el día 42, la positividad de IgG alcanzó el 100% (Fig. 1c) y se mantuvo hasta el día 56, lo que sugiere que el protocolo de vacunación para la cohorte B fue más eficaz. Para el día 90, la positividad de IgG también se redujo al 50%, lo que indica que la producción de anticuerpos no se mantuvo durante mucho tiempo. Además, realizamos pruebas para anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 18 ( Fig.1d ), y los resultados también indicaron que dos inoculaciones con 28 días de diferencia (cohorte B) dieron como resultado títulos de anticuerpos protectores más altos en comparación con dos inoculaciones con 14 días de diferencia ( cohorte A). Por otro lado, parecía que los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-SARS-CoV-2 eran en general más bajos que los de los individuos convalecientes por COVID-19 como se informó antes de 3 (Fig. 1d). A los 90 días, los títulos de anticuerpos neutralizantes disminuyeron drásticamente en todos los voluntarios (Fig. 1d ). Curiosamente, el individuo que tenía anticuerpos positivos antes de la vacunación no era más propenso a generar anticuerpos neutralizantes en comparación con el resto de los participantes, lo que sugiere que una posible infección previa podría no haber ocurrido o no generar una protección duradera en la perspectiva de neutralizar. producción de anticuerpos.

Alteraciones en las mediciones de laboratorio clínico después de la vacunación.

Las pruebas de rutina de laboratorio clínico que incluyen índices relacionados con infecciones, parámetros hematológicos, función de coagulación, glucosa en sangre, lípidos séricos, enzimas relacionadas con la función cardíaca, electrolitos, biomarcadores relacionados con la función hepática y renal, se midieron para revelar las características de seguridad de la vacuna (Fig. . 2a y los cuadros suplementarios S4 y S5 ). El recuento de glóbulos blancos aumentó significativamente, aunque solo ligeramente, después de la vacunación el día 7. No se detectaron diferencias en los siguientes puntos de tiempo (Fig. 2b). Para nuestra sorpresa, se observaron aumentos bastante consistentes en los niveles de HbA1c en voluntarios sanos, independientemente de si pertenecían a la cohorte A o B. Al día 28 después de la primera inoculación, tres de los 11 individuos alcanzaron el rango prediabético (Fig. 2c ). Para los días 42 y 90, los niveles medios de HbA1c parecieron revertirse, pero aún eran significativamente más altos que los de antes de la vacunación. Trabajos anteriores han demostrado que los pacientes diabéticos con niveles de glucosa en sangre no controlados son más propensos a desarrollar formas graves de COVID-19 19 . Se ha demostrado que los niveles altos de glucosa en sangre / glucólisis promueven la replicación del SARS-CoV-2 en monocitos humanos a través de la producción de especies de oxígeno reactivas mitocondriales y la activación de HIF1A 20, presentando por tanto una característica desventajosa.

Fig. 2: Cambios temporales de las mediciones de laboratorio clínico después de la vacunación.
Figura 2

a Las pruebas de rutina de laboratorio clínico incluyen parámetros hematológicos y de coagulación, índices relacionados con la glucosa en sangre y relacionados con infecciones, perfil de lípidos, enzimas cardíacas, electrolitos, biomarcadores relacionados con la función hepática y renal. Se puede encontrar más información en las Tablas complementarias S4 y S5 . Valores de análisis de laboratorio de recuento de glóbulos blancos ( b ), HbA1c ( c ), potasio ( d , panel izquierdo), sodio ( d , panel derecho), TTPA ( e , panel izquierdo), PT ( e , panel derecho), total colesterol ( f ), ácido biliar total ( g ), eGFR ( h , panel izquierdo), creatinina ( h, panel derecho). Los puntos de datos representan los valores de cada individuo. Los diagramas de caja mostraron los percentiles 25, 50 (mediana) y 75. Las líneas discontinuas horizontales mostraban los límites normales superiores (rojo) en b , c , d (paneles izquierdos), e (panel izquierdo), f , hy los límites normales inferiores (azul) en d (panel izquierdo) y h . Los valores de P se calcularon mediante la prueba de rango de signos de Wilcoxon comparando las mediciones de laboratorio en cada momento con las mediciones de la línea de base. * P  ≤ 0.05, ** P  ≤ 0.01, *** P  ≤ 0.001.

Los niveles de potasio sérico disminuyeron significativamente los días 28, 42 y 90 después de la primera inoculación, con una muestra por debajo del límite normal inferior el día 42 (Fig. 2d , panel izquierdo). De manera similar, los niveles de sodio en suero también disminuyeron después de la vacunación (Fig. 2d , panel derecho), lo que indica las influencias de la vacuna sobre el equilibrio de electrolitos. Una vez más, el desequilibrio de electrolitos también se ha relacionado con COVID-19 21 . La coagulopatía es otra condición clínica inducida por COVID-19 22. Encontramos que los perfiles de coagulación cambiaron significativamente después de la vacunación, a corto plazo (7 días) después de la primera inoculación, los perfiles de coagulación se inclinaron hacia un tiempo de protrombina (TP) más corto, mientras que el efecto a largo plazo (28 y 42 días) fue hacia tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) y prolongación del TP (Fig. 2e ). Para el día 90, los perfiles volvieron a los de antes de la vacunación (Fig. 2e ). Además, encontramos niveles elevados de colesterol en sangre en los días 7, 28 después de la primera inoculación, y también se detectaron niveles elevados de ácidos biliares totales en el día 7 ( Fig.2f, g). La disfunción renal es otra condición clínica relacionada con COVID-19, y a los 28, 42 y 90 días después de la primera inoculación, los niveles de creatinina sérica eran significativamente más altos que los anteriores a la vacunación, lo que resulta en una reducción de la TFGe (Fig. 2h ). Se ha informado que la mayoría de estas características clínicas están asociadas con el desarrollo de síntomas graves en pacientes con COVID-19 (Tabla complementaria S6 ). En general, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre las cohortes A y B, excepto solo unos pocos índices (Tabla complementaria S7 ), por lo tanto, los datos de dos cohortes se agruparon para la presentación de datos clínicos y análisis posteriores.

scRNA-seq reveló alteraciones dramáticas en la expresión génica de casi todas las células inmunes después de la vacunación

Para explorar las características inmunológicas de voluntarios sanos después de la vacunación, realizamos scRNA-seq basado en gotitas (10 × Genómica) para estudiar los perfiles transcriptómicos de PBMC de voluntarios pertenecientes a la cohorte A o B, antes y 28 días después de la vacunación ( Fig.3a y Fig. complementaria S1a ). Después del preprocesamiento y la eliminación de células de baja calidad (consulte «Materiales y métodos»), obtuvimos 188,886 células de todas las muestras de PBMC, de las cuales 86,685 células eran de la cohorte A y 102,201 células de la cohorte B. Todas las células calificadas se integraron en el conjunto de datos unificado y sometido a análisis posteriores.

Fig. 3: Cambios en las composiciones de tipo y subtipo de células inmunitarias periféricas, así como en la expresión génica antes y 28 días después de la primera inoculación.
figura 3

una representación UMAP de tipo celda de todas las muestras fusionadas. En total, se identificaron 22 tipos de células mediante firmas de expresión génica específicas del tipo de célula. En total, se representaron 188.886 células. b Gráfico de puntos para genes de firma específicos del tipo de célula. La escala de colores indicaba los niveles de expresión y el tamaño del punto representaba el porcentaje de células por grupo / subtipo que expresaban el gen correspondiente. c Representación UMAP que representa células antes (azul) y después (naranja) de la vacunación. d Mapa de calor de correlación entre muestras pseudogranulares. miPorcentajes de subtipos de células inmunitarias específicas en PBMC totales de cada individuo antes y después de la vacunación. El diagrama de caja representa la distribución de la muestra. Los recuadros azules representaban muestras antes y naranjas después de la vacunación. Los valores de p se basaron en la prueba de Wilcoxon para comparaciones entre grupos antes y después de la vacunación. f Los diagramas de caja mostraron cambios antes y después de la vacunación en el contenido de monocitos de los datos de scRNA-seq (panel izquierdo) y medidas de laboratorio clínico (panel derecho). g Los diagramas de caja mostraron cambios en el contenido de células T CD4 + , CD8 + , así como en el contenido de linfocitos (T + B + NK) antes y después de la vacunación a partir de los datos de scRNA-seq (3 paneles izquierdos) y pruebas de laboratorio (panel derecho). hDEG identificados por muestras pseudogranulares antes y después de la vacunación. i Análisis de sobrerrepresentación de conjuntos de genes HALLMARK de MSigDB que demuestran diferentes características inmunológicas antes y después de la vacunación.

Utilizando la agrupación basada en gráficos de aproximación y proyección de variedad uniforme (UMAP) 23 , el algoritmo 24 de reconocimiento de células individuales (SingleR) y la anotación manual basada en marcadores genéticos canónicos, identificamos 22 tipos o subtipos de células y realizamos análisis de expresión diferencial entre todos los tipos de células (Fig. 3b y Tabla complementaria S8 ). Las células (transcriptomas celulares) de las muestras antes (azul) y después (naranja) de la vacunación estaban claramente separadas en la representación UMAP para ambas cohortes, lo que significaba que las características inmunológicas habían cambiado drásticamente en casi todos los tipos de células inmunes detectadas y de manera constante en todos los voluntarios ( Figura 3c). Entre los 11 pares (antes y después) de muestras de PBMC, se secuenciaron 10 pares juntos y un par se secuenció por separado en un lote diferente. Las distribuciones de UMAP fueron drásticamente similares independientemente de los diferentes lotes, lo que sugiere efectos mínimos de secuenciación por lotes (Fig. Complementaria S1b ). Dos lotes independientes de secuenciación revelaron cambios similares antes y después de la vacunación, lo que sugiere que los cambios son reales, mientras que se usa el método de corrección del efecto por lotes (Harmony 25 ) (Fig. Complementaria S1c-e) daría lugar a una filtración excesiva y la eliminación de los cambios reales provocados por la vacunación. Además, la agrupación de muestras basada en el coeficiente de correlación de Pearson de los transcriptomas indicó que las muestras de las dos cohortes (A y B) se entremezclaban bien entre sí antes y después de la vacunación, mientras que los cambios inducidos por la vacunación se podían observar claramente (Fig. 3d ) . Por lo tanto, para aumentar el poder estadístico, combinamos las dos cohortes para análisis posteriores.

Para revelar las diferencias en las composiciones de tipo celular antes y después de la vacunación, calculamos los porcentajes relativos de todos los tipos de células en las PBMC de cada individuo sobre la base de los datos de scRNA-seq (Fig. 3e ). Observamos disminuciones en el contenido de linfocitos T reguladores CD4 + (CD4.Treg), linfocitos T CD8 + (CD8.T) y linfocitos CD8 + proliferantes (CD8.Tprolif) después de la vacunación (Fig. 3e ). Las disminuciones en el contenido de células γδ-T (gd.T.Vd2) también fueron significativas (Fig. 3e ). Por el contrario, la vacunación aumentó el contenido de monocitos clásicos (Mono.C) CD14 + (Fig. 3e ), de acuerdo con las mediciones de laboratorio clínico (Fig. 3f) .). El contenido total de linfocitos, que incluía todos los linfocitos T CD4 + , todos los linfocitos T CD8 + , linfocitos B y linfocitos NK, no cambió significativamente antes y después de la vacunación, lo que también se confirmó mediante mediciones de laboratorio clínico (Fig. 3g ). Recopilamos un conjunto de datos publicados de 196 pacientes y controles infectados por COVID-19 7 , y analizamos nuestros datos junto con ese conjunto de datos. El resultado indicó que los cambios inducidos por la vacunación en el contenido celular de los cinco subtipos de células inmunes diferentes también cambiaron en las mismas direcciones en los pacientes con COVID-19 en comparación con los controles, excepto para las células T CD8 + en proliferación (Fig. S2 complementaria ).

Para estudiar los cambios detallados en la expresión génica inducidos por la vacunación, fusionamos muestras individuales en muestras pseudogranulares y usamos una prueba de muestras pareadas para identificar genes expresados ​​diferencialmente (DEG) (Fig. 3h y Tabla complementaria S9 ). Los genes significativamente regulados positivamente estaban involucrados en la «señalización de TNFα a través de NF-κB», «respuestas inflamatorias» e «interacción citocina-receptor de citocina», «señalización IL6-JAK STAT3», «coagulación», «hipoxia», que se había informado para COVID-19, mientras que las vías relacionadas con el ciclo celular estaban reguladas negativamente (Fig. 3i ). Estos resultados respaldaron la idea de que la vacunación imitaba una infección 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 1112 .

Los cambios destacados en la expresión génica específicos del subtipo de células inmunitarias reflejaron las alteraciones del laboratorio clínico

Antes de dilucidar la heterogeneidad funcional y los cambios en la expresión génica específicos del tipo celular entre las muestras antes y después de la vacunación, agrupamos las células en 11 tipos principales: (1) células T CD4 + en estado ingenuo , (2) CD8 en estado ingenuo + Células T, (3) células T auxiliares CD4 + (incluidas CD4.T, CD4.Treg y CD4.Tprolif), (4) células T citotóxicas CD8 + (incluidas CD8.T, CD8B.T y CD8.Tprolif ), (5) MAIT, (6) células γδ-T, (7) células NK (incluidas NK, NK proliferativas), (8) células B / plasmablastos (incluidas células B y plasmablastos), (9) monocitos / células dendríticas (incluyendo mono clásico, mono intermedio, mono no clásico, mieloide DC1, mieloide DC2 y plasmacitoide DC), (10) células T efectoras terminales CD4 + y (11) CD8+ células T efectoras terminales. Después de once categorizaciones principales de tipos de células, realizamos comparaciones a nivel de muestra agregando la expresión génica en los principales tipos de células dentro de cada donante y luego realizamos un análisis de expresión diferencial utilizando muscat 26 . Identificamos genes expresados ​​diferencialmente (DEG) entre todos los tipos de células principales (Fig. 4a y Tabla complementaria S10 ) y realizamos un análisis funcional de genes (Fig. 4b). Haciendo eco de los resultados de la medición clínica, los genes relacionados con la «homeostasis del colesterol», la «coagulación» y la «respuesta inflamatoria» (CXCL8, CD14, IL6 y TNFRSF1B), «Señalización de TNFα a través de NF-κB» (NFKB1, NFKB2, NFKBIE, TNFAIP3 , y TNFSF9) e «hipoxia» (HIF1A) se regularon positivamente. Además, los genes relacionados con la “señalización de TGFβ”, la “señalización de IL2-STAT5” (IFNGR1, MAPKAPK2 y CASP3) y la “señalización de IL6-JAK-STAT3” también estaban regulados positivamente (Fig. 4c ). Para visualizar qué tipos de células se enriquecieron para esas firmas, realizamos la puntuación del módulo genético y mostramos las puntuaciones en las coordenadas UMAP, así como en diagramas de caja agrupados (Fig. 4c y Tabla complementaria S11). Curiosamente, los genes de la «respuesta inflamatoria» se expresaron en gran medida en los monocitos y después de la vacunación aumentaron aún más (Fig. 4c ), lo que sugiere que los monocitos fueron uno de los principales tipos de células que participaron en las respuestas inflamatorias después de la vacunación. Por el contrario, los genes relacionados con la «glucólisis», el «metabolismo de los ácidos biliares» y la «respuesta del interferón tipo I (IFN-α / β)» se regularon negativamente, de acuerdo con nuestros datos clínicos y la fisiopatología de COVID-19 13 (Fig. 4d ).

Fig. 4: Expresión génica diferencial específica de subtipo y análisis de sobrerrepresentación de conjuntos de genes que muestran cambios comunes en la expresión génica entre diferentes tipos de células inmunes después de la vacunación.
Figura 4

a 11 DEG principales específicos del tipo de célula inmunitaria identificados mediante datos pseudogranulares producidos por combinaciones de muestras antes y después de la vacunación. Se incluyeron genes con logFC> 0,5 y ajuste P  <0,05. b El análisis de sobrerrepresentación de conjuntos de genes HALLMARK de MSigDB entre los 11 tipos de células principales demostró cambios comunes en conjuntos de genes que representan estados inmunológicos alterados antes y después de la vacunación. c , d Visualización UMAP coloreada por puntajes de expresión promedio (niveles) basados ​​en la vía de enriquecimiento diferencial. Diagrama de caja que representa la distribución de la puntuación de expresión antes y después de la vacunación.

Los cambios más comunes en múltiples subtipos de células inmunes revelaron aumentos en la señalización de NF-κB y disminuciones en las respuestas de IFN-α / β

Dado que los grupos de genes cambiaron drásticamente su expresión entre todos los tipos de células principales, planteamos la hipótesis de que podría haber algunos factores de transcripción que actúan como reguladores maestros que conducen a alteraciones inmunológicas. Para resolver los desafíos computacionales asociados con un conjunto de datos tan grande, usamos el algoritmo 27 de MetaCell para agregar grupos homogéneos de células en metacélulas, y finalmente producimos 1857 metacélulas (893 antes y 964 después de la vacunación) para representar la estructura completa de scRNA-seq. datos (Fig. 5a ). Luego, esas metacélulas se aplicaron a la «inferencia y agrupación de redes reguladoras de una sola celda (SCENIC)» 28 , 29.para construir las redes reguladoras de genes. El flujo de trabajo produjo una lista de 157 «regulones», que incluían factores de transcripción y sus objetivos directos. Las actividades de regulón se puntuaron usando AUCell para acceder al enriquecimiento promedio de todos los genes que pertenecen a cada regulón en cada metacélula, así como al enriquecimiento promedio del gen de regulón en las 893 metacélulas antes de la vacunación y 964 metacélulas después de la vacunación. Se identificaron ocho regulones regulados al alza y ocho regulones regulados al alza (los más activos) en el rango superior después de la vacunación (Fig. 5b ). Seleccionamos 3 + 3 regulones típicos para construir una red reguladora como se presenta en la Fig.5c (Tabla complementaria S12). La red mostró dos grupos distintos, uno está formado por IRF2, STAT1 y STAT2, que fueron regulados a la baja después de la vacunación, y el otro, contenía RELB, NFKB2 y HIF1A, que fueron regulados al alza después de la inoculación. Los términos GO de la red regulada al alza están relacionados predominantemente con la diferenciación, activación y «formación del centro germinal» de linfocitos, lo que sugiere que las células T y las células B se activaron después de la vacunación. Además, la señalización de NF-κB también se elevó después de la vacunación. La red regulada a la baja se enriqueció para muchas vías relacionadas con los interferones y la secreción de citocinas (figura 5d y tabla complementaria S13). Esto sugirió que la vacunación podría inhibir las respuestas de interferón en el sistema inmunológico periférico, al reducir las actividades de los regulones STAT1, STAT2 e IRF2, que se pensaba que eran factores de transcripción maestros que impulsan la señalización del interferón de tipo I y III 30 , 31 .

Fig. 5: Identificación de regulones maestros y sus redes reguladoras antes y después de la vacunación.
Figura 5

a Visualización de las metacélulas de “asociación de estructura de similitud” en los datos de scRNA-seq originales. Las metacélulas se codificaron por colores de acuerdo con sus anotaciones de tipo de celda. Los datos de scRNA-seq originales se codificaron con colores «azul» y «naranja» para representar las muestras «antes» y «después» de la vacunación, respectivamente. b Paneles superiores: rango de los regulones en las muestras antes (izquierda) y después (derecha) de la vacunación, según la puntuación de especificidad de Regulon (RSS). Paneles inferiores: mapa de calor de las actividades de regulón mejor clasificadas antes (azul) y después (naranja) de la vacunación según las puntuaciones AUCell. Los nombres de los regulones son de color (azul / naranja) y están codificados con números (1–8). CRed de regulones y sus genes diana. La siguiente tabla indica la proporción de genes dentro de los regulones que se regularon al alza o a la baja después de la vacunación. d Anotación funcional del gen y genes relacionados antes (azul) y después (naranja) de la vacunación. e Descripción esquemática del experimento. f Después del tratamiento con IFN-α / β, las PBMC de los voluntarios después de la vacunación presentaron una expresión reducida de genes asociados con las respuestas al interferón tipo I en comparación con las de antes de la vacunación. Se utilizó la prueba de Wilcoxon emparejada. * P  ≤ 0,05, n  = 6.

Para confirmar la inhibición inducida por la vacunación de las respuestas de interferón reveladas por scRNA-seq, estimulamos PBMC de individuos vacunados antes y 28 días después de la vacunación con IFN-α / β. Después de 16 h de cultivo y 12 h de estimulación, utilizamos RT-qPCR para medir la expresión relativa de los reguladores maestros IRF2, IRF7 y STAT2. STAT2 e IRF7 se regularon significativamente a la baja después de la vacunación, sin embargo, IRF2 mostró una tendencia a la regulación a la baja (Fig. 5e, f ). Los análisis de regulones indicaron que los estados del sistema inmunológico periférico después de la vacunación habían reducido las respuestas de interferón de tipo I, indicativo de capacidades antivirales generales atenuadas al menos 28 días después de la primera inoculación.

Respuestas inflamatorias inducidas por vacunación en monocitos

Informes recientes han descrito firmas conservadas de la respuesta inmune del huésped a las infecciones virales respiratorias, a saber, la Firma del Meta-Virus (MVS), que también se conserva en la infección por SARS-CoV-2 32 , 33 . Las puntuaciones más altas de MVS se asocian con la infección 32 , 33 . En total, 380 (158 contribuyeron positivamente y 222 negativamente a las puntuaciones MVS) de 396 (161 contribuyeron positivamente y 235 contribuyeron negativamente) genes seleccionados para la medición de MVS se detectaron en nuestro conjunto de datos. Para investigar las respuestas inmunes del huésped después de la vacunación con SARS-CoV-2 inactivado, separamos los conjuntos de genes positivos y negativos y calculamos las puntuaciones de MVS (Fig. 6a ). Las puntuaciones MVS fueron sustancialmente más altas después de la vacunación ( Fig.6b, c), lo que sugiere que la vacunación imita una infección. Curiosamente, el conjunto de genes MVS positivo se expresó predominantemente en monocitos, mientras que el conjunto negativo en linfocitos, lo que indica que se producirían diferentes respuestas inmunitarias específicas de tipo celular después de la vacunación (Fig. Suplementaria S3a, b ).

Fig. 6: Los monocitos mostraron puntuaciones MVS altas y vías correlacionadas con las puntuaciones MVS.
figura 6

una visualización UMAP coloreada por puntuaciones MVS. b Las puntuaciones de MVS en muestras pseudogranulares que combinaban todos los tipos de células mostraron regulación positiva después de la vacunación. c Diagramas de caja que representan la distribución de la puntuación entre los 11 tipos principales de células inmunitarias antes y después de la vacunación. d Mapa de calor de la correlación entre las puntuaciones de MVS y las vías enriquecidas de genes expresados ​​diferencialmente antes y después de la vacunación.

Para investigar qué vías estaban asociadas con el conjunto de genes MVS-positivo y el conjunto de genes MVS-negativo, calculamos la correlación de Spearman entre las puntuaciones de conjuntos de genes MVS e identificamos previamente vías enriquecidas diferencialmente utilizando nuestros datos de scRNA-seq (Fig. 6d ). La vía más altamente correlacionada con la puntuación MVS y el conjunto MVS positivo fue la «señalización de la respuesta inflamatoria», que se incrementó notablemente en los monocitos después de la vacunación, junto con CD14, FPR1, C5AR1, NAMPT, NLRP3, CDKN1A e IFNGR2. Mientras que el conjunto MVS negativo se correlacionó bien con la «firma de citotoxicidad», representada por la expresión de NKG7, CCL4, CST7, PRF1, GZMA, GZMB, IFNG y CCL3, disminuyó significativamente en muchos subtipos de células T pero no en las células NK después de la vacunación (complementario Fig. S3c ).

Discusión

Esta es una investigación exhaustiva de los cambios fisiopatológicos, incluidas las alteraciones inmunológicas detalladas en las personas después de la vacunación COVID-19. Los resultados indicaron que la vacunación, además de estimular la generación de anticuerpos neutralizantes, también influyó en diversos indicadores de salud, incluidos los relacionados con la diabetes, disfunción renal, metabolismo del colesterol, problemas de coagulación, desequilibrio electrolítico, como si los voluntarios experimentaran una infección. scRNA-seq de PBMC de voluntarios antes y después de la vacunación reveló cambios dramáticos en la expresión génica de las células inmunes, no solo haciéndose eco de algunas de las medidas de laboratorio clínico, sino que también sugiere un aumento de las respuestas inflamatorias relacionadas con NF-κB, que resultó estar ocurriendo principalmente en monocitos clásicos. La vacunación también aumentó el contenido de monocitos clásicos. Además, el conjunto de genes que contribuye positivamente a las puntuaciones de MVS, también conocido por estar asociado con el desarrollo de síntomas graves, se expresó en gran medida en monocitos. Las respuestas al interferón de tipo I (IFN-α / β), supuestamente beneficiosas contra COVID-19, se regularon negativamente después de la vacunación. Además, los genes MVS negativos se expresaron en gran medida en linfocitos (células T, B y NK), pero mostraron una expresión reducida después de la vacunación. Juntos, estos datos sugirieron que después de la vacunación, al menos para el día 28, además de la generación de anticuerpos neutralizantes, el sistema inmunológico de las personas, incluidos los linfocitos y monocitos, estaba quizás en un estado más vulnerable. supuestamente beneficiosos contra COVID-19, fueron regulados a la baja después de la vacunación. Además, los genes MVS negativos se expresaron en gran medida en linfocitos (células T, B y NK), pero mostraron una expresión reducida después de la vacunación. Juntos, estos datos sugirieron que después de la vacunación, al menos para el día 28, además de la generación de anticuerpos neutralizantes, el sistema inmunológico de las personas, incluidos los linfocitos y monocitos, estaba quizás en un estado más vulnerable. supuestamente beneficiosos contra COVID-19, fueron regulados a la baja después de la vacunación. Además, los genes MVS negativos se expresaron en gran medida en linfocitos (células T, B y NK), pero mostraron una expresión reducida después de la vacunación. Juntos, estos datos sugirieron que después de la vacunación, al menos para el día 28, además de la generación de anticuerpos neutralizantes, el sistema inmunológico de las personas, incluidos los linfocitos y monocitos, estaba quizás en un estado más vulnerable.

Curiosamente, nuestros datos preliminares demostraron que si preincubamos RBD de SARS-CoV-2 con las PBMC (de voluntarios antes y después de la vacunación) y luego tratamos las células con IFN-α / β, las respuestas de interferón tipo I en realidad mejoraron en PBMC después de la vacunación, lo que sugiere que quizás la vacuna, aunque redujo la capacidad antiviral general de una persona, mejoró la función inmune adaptativa específicamente hacia el SARS-CoV-2 (Fig. Complementaria S4a ). Por otra parte, la comparación de las PBMC antes de la vacunación, el tratamiento previo de SARS-CoV-2 S-RBD pareció reducir interferón de tipo I las respuestas ( P  <0,05, IRF2, IRF7, STAT2) (complementario Fig. S4b), lo que sugiere que la exposición por primera vez del péptido viral en realidad causaría una reducción en las respuestas de interferón tipo I en PBMC. Estos datos in vitro respaldaron muy bien los resultados de scRNA-seq.

Vale la pena mencionar que un individuo de la cohorte A que estaba tomando antibióticos, resultó que no tenía una expresión génica reducida relacionada con las respuestas de interferón tipo I, y este individuo también tenía el título de anticuerpos neutralizantes más alto dentro de la cohorte. Calculamos además el coeficiente de correlación de Pearson entre los títulos de anticuerpos neutralizantes y las respuestas inflamatorias medidas por la expresión génica promediada de genes asociados con la señalización de TNFα a través de respuestas de NF-κB e interferón-α (interferón de tipo I). Los resultados fueron 0.32 y 0.39 con P  > 0.05 (Fig. Suplementaria S4c), respectivamente, lo que sugiere que los cambios en la respuesta inmune y la protección inmune adaptativa de la vacuna no parecen estar altamente correlacionados. Queda por determinar si los antibióticos pueden influir en la eficacia de la vacuna. También es bastante interesante que, si bien las cohortes A y B tenían diferentes perfiles de producción de anticuerpos anti-SARS-CoV-2, sus resultados de scRNA-seq de PBMCs fueron drásticamente similares, incluidos sus datos de scRNA-seq de células B (Fig. Complementaria S5a-c). Cabe señalar que después de la vacunación, la mayoría de las células B sensibles, en particular las que producen anticuerpos anti-COVID-19 (IgG) maduros, incluidas las células B de memoria, deben ubicarse principalmente en tejidos linfáticos periféricos como los ganglios linfáticos y el bazo, mientras que sólo existirían unas pocas células B maduras en la circulación. Por lo tanto, la población de células B en las preparaciones de PBMC puede no reflejar todo el espectro de inmunidad humoral.

Los análisis presentados en este estudio, particularmente, scRNA-seq de PBMCs no se habían realizado para evaluaciones previas de vacunas, si los cambios en los genes relacionados con la función del sistema inmunológico eran específicos de COVID-19 o podrían aplicarse generalmente a otras vacunas u otros tipos de las vacunas COVID-19 quedaban por determinar. Sin embargo, estos tipos de análisis detallados deberían ser beneficiosos en general para el desarrollo y las aplicaciones de vacunas. Nuestro estudio postula que es imperativo considerar el impacto potencial a largo plazo de la vacunación en ciertas condiciones médicas 34 o en la salud humana en general.

Materiales y métodos

Participantes, recopilación de datos clínicos y procedimientos

Se reclutaron voluntarios adultos sanos para el programa. Todos los sujetos se sometieron a un examen físico y completaron un cuestionario por médicos capacitados. Se inscribió en el estudio a un adulto sano de 18 a 60 años, con temperatura axilar ≤ 37,0 ° C, negativo para la prueba de ácido nucleico del SARS-CoV-2 y dispuesto a completar todos los procesos programados del estudio. Se excluyeron las personas con epilepsia, enfermedades cerebrales o mentales, antecedentes de alergias, enfermedades crónicas importantes no controladas y hallazgos anormales clínicamente significativos en las pruebas bioquímicas y hematológicas. También se excluyeron las mujeres embarazadas o en período de lactancia. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Shanghai East Hospital de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki (No.2020 (096)). Se obtuvieron los consentimientos informados por escrito de todos los participantes antes de la inscripción.

Se inscribió y vacunó a un total de 11 participantes para evaluar la seguridad clínica y los cambios dinámicos en el sistema inmunológico. Entre estos, cinco participantes (cohorte A) fueron vacunados con una dosis de 4 μg de la vacuna inactivada contra el SARS-CoV-2 (Vero Cell) los días 1 y 14, y seis participantes (cohorte B) recibieron una dosis de 4 μg de la vacuna los días 1 y 28. Se administró la vacuna inactivada contra el SARS-CoV-2 (Vero Cell) (China Biotechnology Group Corporation) por vía intramuscular en el deltoides. Todas las vacunas fueron aprobadas por los Institutos Nacionales de Control de Alimentos y Medicamentos de China.

Pruebas de seguridad de laboratorio que incluyen índices relacionados con infecciones (proteína C reactiva, proteína amiloide A sérica), parámetros hematológicos (recuentos de glóbulos blancos, recuentos de neutrófilos, recuentos de linfocitos, recuentos de monocitos, recuentos de glóbulos rojos, hemoglobina, recuentos de plaquetas), función de coagulación -índices relacionados (tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial activada / TTPA, fibrinógeno, actividad de protrombina / TP, índice internacional normalizado / INR), parámetros relacionados con la glucosa en sangre (glucosa plasmática en ayunas, HbA1c), lípidos séricos (colesterol total, triglicéridos, HDL -C, LDL-C), enzimas relacionadas con la función cardíaca (creatinina quinasa, CK-MB), electrolitos (potasio, sodio, cloruro, bicarbonato, calcio total, magnesio), biomarcadores relacionados con la función hepática (p. Ej., Albúmina, alanina aminotransferasa / ALT, aspartato aminotransferasa / AST, bilirrubina total, etc.),Se midieron los marcadores relacionados con la función renal (creatinina, ácido úrico, nitrógeno en sangre y orina / BUN, tasa de filtración glomerular estimada / TFGe).

Prueba de anticuerpos COVID-19 (IgG / IgM)

Varios kits de prueba rápida de anticuerpos COVID-19 (IgG / IgM) disponibles comercialmente, incluidos «Innovita (proteína S específica)», «GenBody (proteína N específica)», «Livzon (proteínas S + N)» y «AbKhan ( Proteínas S + N) ”se utilizaron para analizar la positividad de anti-COVID-19 (IgM / IgG) de plasma de voluntarios antes y en diferentes momentos después de la vacunación. El kit «AbKhan» era el más sensible y los datos se utilizaron en este estudio.

Prueba de anticuerpos neutralizantes por PRNT

Las muestras de suero se analizaron utilizando un ensayo de neutralización por reducción de placa (PRNT) para el SARS-CoV-2 (2019-nCoV-WIV04) en el laboratorio BSL-3. Brevemente, los sueros se inactivaron por calor a 56 ° C durante 30 min y se diluyeron a 1:50, seguido de diluciones seriadas triples (1:50, 1: 150, 1: 450, 1: 1350, 1: 4050 y 1: 12,150). A continuación, los sueros se mezclaron con 100 UFP de virus y se incubaron a 37ºC durante 1 h. A continuación, se inocularon las mezclas de dilución virus-suero y el control del virus en monocapas de células Vero E6 en placas de 24 pocillos durante 1 h antes de añadir un medio de superposición que incluía metilcelulosa al 1,5% a 37 ° C durante 4-5 días para permitir el desarrollo de la placa. Luego, las placas se fijaron y se tiñeron con violeta cristal al 2% en metanol al 30% durante 30 min a temperatura ambiente, y las placas se contaron y midieron manualmente.

Preparación de suspensiones unicelulares, preparación de bibliotecas de ARN unicelulares y secuenciación

Las PBMC se aislaron de sangre venosa heparinizada de voluntarios sanos utilizando un medio Ficoll-Paque TM PLUS (GE Healthcare Inc.) de acuerdo con el método de centrifugación en gradiente de densidad estándar proporcionado por el fabricante. Las PBMC se congelaron en medio de congelación (70% RPMI-1640, 20% FBS y 10% DMSO) y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso. La captura de una sola célula y la construcción de la biblioteca se realizaron utilizando el kit Chromium Single Cell 5 ‘Library & Gel Bead (10 × Genomics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas se secuenciaron utilizando la plataforma Novaseq 6000 (Illumina).

Análisis y estadísticas de datos de scRNA-seq

Los datos de secuenciación de una sola célula se alinearon y cuantificaron usando kallisto / bustools (KB, v0.25.0) 35 contra el genoma de referencia humano GRCh38 descargado del sitio web oficial de 10 × Genomics. A continuación, se utilizaron los recuentos preliminares para los análisis posteriores. Hicimos una canalización para procesar datos. Brevemente, se filtraron las células con menos de 200 genes, Scanpy 36 realizó los recuentos logarítmicos normalizados y la selección de los 3000 genes altamente variables (HVG) superiores .

Excluimos genes específicos de HVG, incluidos genes mitocondriales, genes de inmunoglobulina y genes vinculados a modelos transcripcionales con escasa compatibilidad (anotados con el prefijo «Rp-«). Luego, se realizó el análisis de componentes principales (PCA) utilizando los HVG y se utilizó el algoritmo Harmony para eliminar los efectos por lotes 25 . Usamos el enfoque PARC para identificar agrupaciones 37 y características seleccionadas mediante la función «FeatureSelectionByEnrichment» del algoritmo 38 cytograph2 , seguida de otra ronda de PCA, Harmony y PARC. Posteriormente, calculamos K vecinos más cercanos en un gráfico KNN, realizamos la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) por Pegasuspy 39 e identificamos los conglomerados por PARC. Además, aplicamos Scrublet 40 para identificar dobletes potenciales.

El control de calidad se aplicó a los clústeres en función del resultado de la primera ronda de la tubería:

  1. 1.Los grupos con más del 20% de células de los cuales una puntuación de doblete> 0,4 ​​se definieron como grupos de dobletes.
  2. 2.Los grupos con más del 20% de células que tenían> 20% de sus transcripciones mapeadas en genes mitocondriales se definieron como grupos de baja calidad.
  3. 3.Los grupos con más del 20% de células que tenían <0,05% de sus transcripciones mapeadas en genes mitocondriales se definieron como núcleos.
  4. 4.Expresión mediana de PPBP, PF4, HBB, HBA2> 0, lo que indica eritrocitos y plaquetas.
  5. 5.Menos de 50 celdas.
  6. 6.Números de genes detectados <1000.
  7. 7.Relación de la media de los UMI totales y la media de los genes detectados <2.
  8. 8.Scrublet identificó dobletes.
  9. 9.Usando DBSCAN 41 para eliminar valores atípicos.

Después de eliminar las células de baja calidad, anotamos las células mediante el algoritmo de reconocimiento de células individuales de tipos de células (SingleR), en referencia a los conjuntos de datos inmunitarios de Mónaco 42 .

Las células calificadas se sometieron a análisis aguas abajo. De manera similar, volvemos a ejecutar el proceso para identificar los principales tipos de células, incluidas las células T (CD3D, CD3E, CD3G, CD40LG, CD8A, CD8B), células B (MS4A1, CD79A, CD79B), células NK (GNLY, NKG7, TYROBP, NCAM1), y monocitos (CST3, LYZ). Además, ejecutamos la tubería en cada tipo de células, respectivamente, y más subtipos identificados en función de los tipos de células identificadas con SingleR y marcadores bien caracterizados (Fig. 3b ).

Comparación de la proporción de células inmunes

Para las muestras de PBMC, calculamos las proporciones de células inmunes para cada tipo de célula principal y subtipos subyacentes. Para cada muestra, la proporción de tipo de celda se calculó por el número de celdas en un determinado tipo de celda dividido por el número total de celdas. Para identificar los cambios en las proporciones de células entre muestras en diferentes grupos, realizamos una prueba de Wilcoxon en las proporciones de cada tipo de célula principal, así como subtipos de células en diferentes grupos (Fig. Complementaria S2 ).  En la Fig. 3e solo se muestran los tipos de células con diferencias estadísticamente significativas ( P <0,05) en proporciones .

Análisis de expresión diferencial, análisis de sobrerrepresentación de conjuntos de genes y módulos de firma de puntuación

Para investigar las alteraciones de las características inmunológicas, identificamos los DEG mediante el algoritmo 26 de muscat con los parámetros predeterminados. Brevemente, primero sumamos y colapsamos los datos, sumando los UMI en las células de cada donante sano, para producir un perfil de UMI de estilo RNA-seq a granel para cada muestra. Posteriormente, los recuentos agregados se cargaron en la función pbDS para identificar los DEG, y los mapas de calor se trazaron mediante la función pbHeatmap. El análisis de sobrerrepresentación de conjuntos de genes de DEG (logFC> 0.5 y P ajustado  <0.05) se realizó utilizando la prueba exacta de Fisher unilateral (como se implementó en el paquete R «gsfisher») con el gen «HALLMARK», «KEGG» y «REACTOME» conjuntos derivados de MSigDB. Conjuntos de genes con P <0,05 se consideraron significativos. Las puntuaciones de los módulos de firma se calcularon mediante la función «AddModuleScore», con la configuración predeterminada en Seurat. Brevemente, para cada célula, la puntuación se definió como la expresión promedio de la lista de genes de firma restando la expresión promedio de la lista de genes de control correspondiente 43 . Las listas de genes utilizadas para el análisis se proporcionan en la Tabla complementaria S11 .

Análisis de metaceldas

Usamos el paquete R “MetaCell” 27 para analizar los datos. Eliminamos genes mitocondriales específicos, genes de inmunoglobulina y genes vinculados a modelos transcripcionales con escasa compatibilidad (anotados con el prefijo «Rp-«). Luego filtramos las células con menos de 500 UMI. Las características de los genes se seleccionaron usando el parámetro Tvm = 0.08 y un recuento de UMI total mínimo> 100. Posteriormente, realizamos un agrupamiento jerárquico de la matriz de correlación entre esos genes (filtrando genes con baja cobertura y computando la correlación usando una matriz de UMI con muestreo reducido) y seleccionamos grupos de genes que contienen genes de anclaje. Usamos K  = 100 y 500 iteraciones de arranque y otros parámetros estándar. Las metacélulas fueron anotadas por los tipos de células más abundantes que componen cada metacélula.

Análisis de la red reguladora de genes

Para la identificación y puntuación de la actividad del regulón, empleamos pySCENIC 28 , 29flujo de trabajo sobre datos de metacélulas logarítmicas normalizadas para determinar conjuntos de genes coexpresados. Vinculamos los objetivos directos a sus factores de transcripción correspondientes utilizando las bases de datos RcisTarget (v1.2.1) y retenemos genes putativos aguas abajo con motivos de ADN enriquecidos a 10 kb o 500 pb desde el sitio de inicio de la transcripción (puntuación de enriquecimiento normalizado> 3). Finalmente, utilizamos la función AUCell para puntuar la actividad de cada regulón en las células del conjunto de datos, que se calculó como la suma de genes expresados ​​por regulón y produjo matrices de actividad binaria basadas en puntos de corte ajustados manualmente después de inspeccionar las distribuciones de las puntuaciones AUC. Las puntuaciones de especificidad de regulon (RSS) se calcularon mediante la función «regulon_specificity_scores» del algoritmo pySCENIC con parámetros predeterminados.

Análisis de la respuesta de IFN-α / β de PBMC

Las PBMC se aislaron de sangre heparinizada mediante Ficoll-Hypaque a 400 xg durante 30 min. Las PBMC (1 x 10 6  ml -1 ) de los donantes antes y después de la vacunación se sembraron luego en placas de cultivo de 48 pocillos con RPMI-1640 que contenía un 5% de reemplazo de suero knockout y heparina al 0,032%. Al día siguiente, se cambió el medio y las células se trataron con 100 ng / ml de IFN-α y 10 ng / ml de IFN-β durante 12 h. Algunas células se pretrataron con 250 ng / ml de RBD durante 16 h, seguido de tratamiento con IFN-α / β durante 12 h. Después del lavado y la extracción del ARN total, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real para detectar la expresión de genes asociados a la respuesta al interferón de tipo I. Los cambios de pliegue en relación con GAPDH se calcularon por 2 -ΔΔCty expresado como media ± SEM. Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student pareada y se consideraron significativas cuando P  <0,05.

análisis estadístico

Los datos clínicos se resumieron utilizando la media (desviación estándar), la mediana (Q1, Q3) o el número (porcentaje), cuando fue apropiado. La prueba de rango con signo de Wilcoxon se utilizó para comparar medianas emparejadas a lo largo del tiempo para las características de laboratorio. Además, se utilizó la prueba de rango de suma de Wilcoxon para comparar los cambios medianos desde el inicio entre las cohortes A y B. Clasificamos los eventos adversos de acuerdo con la escala emitida por la Administración Nacional de Productos Médicos de China ( https://www.nmpa.gov. cn / xxgk / ggtg / qtggtg / 20191231111901460.html ) y el juicio de los resultados de las pruebas de laboratorio se basó en el rango de valores de referencia de la población local. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras. La significancia estadística se definió como P ≤ 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SAS v9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.).

Disponibilidad de datos

Los números de acceso para la secuenciación de datos brutos y datos procesados ​​en este documento son Genome Sequence Archive in BIG Data Center (GSA, Instituto de Genómica de Beijing, Academia de Ciencias de China): HRA001150.

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