El acoplamiento covalente del dominio de unión del receptor de Spike a un transportador multimérico produce una alta respuesta inmune contra el SARS-CoV-2

El dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína Spike del SARS-CoV-2 es un candidato prometedor para desarrollar vacunas efectivas contra el COVID-19, ya que puede inducir potentes anticuerpos neutralizantes. Anteriormente informamos sobre la producción altamente eficiente de RBD en Pichia pastoris , que es estructuralmente similar a la misma proteína producida en células HEK-293T de mamíferos. En este trabajo diseñamos un multímero RBD con el fin de aumentar su inmunogenicidad. Producimos partículas multiméricas por una reacción de transpeptidación entre RBD expresada en P. pastoris y Lumazina Sintasa de Brucella abortus(BLS), que es una proteína decamérica de 170 kDa altamente inmunogénica y muy estable. Tales partículas se usaron para vacunar ratones con dos dosis con 30 días de diferencia. Cuando la proporción de partículas de RBD a unidades BLS era alta (6 a 7 moléculas RBD por decámero BLS en promedio), la respuesta inmune humoral fue significativamente mayor que la provocada por RBD solo o por partículas RBD-BLS con una menor proporción RBD a BLS. (1–2 moléculas RBD por decámero BLS). Sorprendentemente, las partículas multiméricas con un alto número de copias de RBD provocaron un alto título de IgG neutralizantes. Estos resultados indican que las partículas multiméricas compuestas por RBD covalente acoplado a BLS poseen una arquitectura ventajosa para la presentación de antígenos al sistema inmunitario y, por lo tanto, mejoran la inmunogenicidad de RBD. Por lo tanto, las partículas RBD-BLS multiméricas son candidatas prometedoras para una vacuna basada en proteínas.

El coronavirus SARS-CoV-2, que se detectó hace aproximadamente 1 año en Wuhan, República de China en diciembre de 2019, ha producido más de 4,88 millones de muertes para octubre de 2021 ( https://ourworldindata.org/covid-deaths ). Desde el descubrimiento de la nueva cepa, se han desarrollado varias vacunas ( https://covid19.trackvaccines.org/vaccines/ ), basadas en virus inactivados, ADN, ARN y/o proteínas ^{1 , 2 , 3} . Además, se ha demostrado que los antígenos multivalentes que imitan la presentación de antígenos por partículas virales inducen una respuesta inmunitaria más fuerte que los antígenos monoméricos ⁴, permitiendo así la inmunización con dosis más bajas de antígeno, así como la combinación de diferentes variantes de antígeno. Este enfoque permitiría la inmunización simultánea contra los múltiples linajes del SARS-CoV-2 que lamentablemente han surgido en todo el mundo ⁵ .

El dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína Spike del SARS-CoV-2 es responsable de la interacción del virus con el receptor de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) ⁶ , que permite la penetración del virus en las células. Por tanto, RBD constituye una diana adecuada para desarrollar herramientas diagnósticas y terapéuticas, así como vacunas. Se ha encontrado que varios anticuerpos neutralizantes producidos por la infección por SARS-CoV-2 se dirigen hacia RBD ^7 , 8 . Recientemente se ha determinado la estructura del complejo formado por el SARS-CoV-2 RBD y la ACE2 humana ⁹ . A diferencia del SARS-CoV-1, varios cambios de residuos en el SARS-CoV-2 RBD estabilizan dos puntos críticos de unión al virus en la interfaz RBD/ACE2, lo que aumenta su afinidad por ACE2 ⁹ .

La RBD de SARS-CoV-2 Spike es una proteína difícil de producir en sistemas heterólogos porque tiene nueve residuos de cisteína (ocho de los cuales forman enlaces disulfuro), una topología compleja y dos sitios de N-glicosilación ^10 , 11 . Por estas razones, RBD a menudo se expresa en células de mamíferos ^9 , 12 . Sin embargo, nuestro consorcio AntiCovid pudo producir RBD con altos rendimientos en Pichia pastoris, con una estabilidad, propiedades biofísicas e inmunogenicidad similares a las de RBD producido en células HEK-2913T de mamíferos ¹². Sorprendentemente, la producción de RBD en células de levadura es muy rentable y el bioproceso de fermentación se puede ampliar fácilmente en condiciones de buenas prácticas de fabricación. En experimentos a escala piloto en un biorreactor logramos rendimientos de 180 mg L – ¹ de ~90% de RBD pura en P. pastoris , que actualmente se utiliza como antígeno para kits de pruebas serológicas y como inmunógeno. RBD puede usarse para producir anticuerpos neutralizantes a gran escala en sistemas animales como la yema de huevo (IgY) ^13 , 14 o en caballos ¹⁵ .

Si bien RBD es inmunogénico per se, una mayor mejora de su inmunogenicidad debería permitir el desarrollo de una nueva generación de vacunas de subunidades, que idealmente deberían ser capaces de proporcionar inmunidad simultáneamente contra las diferentes variantes emergentes de RBD. Una posible estrategia para lograr este objetivo es acoplar RBD a una proteína transportadora inmunogénica. La lumazina sintasa (LS, EC 2.5.1.78) de Brucella abortus (BLS) es una proteína decamérica altamente inmunogénica y muy estable, ideal para funcionar como transportador inmunogénico. Cinco subunidades BLS (17 kDa cada una) forman un pentámero, y dos pentámeros un decámero muy estable, que puede decorarse con cualquier proteína cuya antigenicidad deba aumentarse acoplándola al extremo N-terminal de BLS ^{16 , 17 , 18}. Además, el BLS activa las células dendríticas in vitro, aumentando los niveles de moléculas coestimuladoras y la secreción de citocinas proinflamatorias, y también recluta células dendríticas in vivo, en ambos casos de forma dependiente de TLR4 ¹⁹ . Además, las quimeras de BLS son extremadamente eficaces para activar rápidamente linfocitos CD8+ específicos y para inducir una actividad citotóxica significativa ²⁰ . Mientras que otras proteínas portadoras se han unido de forma no covalente a proteínas diana a través de un par de proteínas que interactúan (por ejemplo, X-dockerin-cohesin-Y ²¹donde X e Y son proteínas expresadas como una proteína de fusión con los dominios de dockerina y cohesina, respectivamente), tales interacciones no covalentes pueden ser relativamente débiles, particularmente para propósitos de inmunización, que normalmente requieren el uso de adyuvantes fuertes. La fusión traduccional de proteínas y péptidos diana con BLS ha permitido a los investigadores superar este problema ²² . Sin embargo, dado que las fusiones BLS suelen expresarse con altos rendimientos en Escherichia coli , esta estrategia puede no ser adecuada para proteínas con estructura compleja y alto contenido de enlaces disulfuro, y/o que requieren modificaciones postraduccionales, como es el caso de RBD , que no se puede expresar correctamente en E. coli ¹². Este problema podría evitarse mediante el acoplamiento covalente de RBD y BLS in vitro , en su estado nativo, utilizando la enzima Sortasa A.

Sortasa A y sus variantes pueden catalizar eficientemente una reacción de transpeptidación que crea un enlace covalente entre dos proteínas o péptidos nativos ²³ . Esta reacción requiere que la proteína N-terminal esté unida covalentemente para contener una señal específica ubicada en su tramo C-terminal: Proteína ^N -Leu-Pro-X-Thr-Gly (Fig.  1 ). Este sitio debe estar preferiblemente en un contexto no estructurado, y el residuo de Gly suele ir seguido de una etiqueta de histidina para facilitar su purificación. La proteína C-terminal a unir covalentemente debe contener tres residuos de aminoácidos Gly en su región N-terminal (Gly-Gly-Gly- Proteína ^C). Después de la reacción de transpeptidación de Sortasa A, ambas subunidades se unen para producir el producto de unión covalente Proteína ^N -Leu-Pro-X-Thr-Gly-Gly-Gly- Proteína ^C (Fig.  1 ). Por lo tanto, la reacción de transpeptidación mediada por Sortasa A puede acoplar portadores oligoméricos preensamblados, como BLS o partículas similares a virus (VLP), a un inmunógeno expresado en un sistema diferente ²⁴ . Una ventaja adicional del acoplamiento mediado por Sortasa A es que la cicatriz de la reacción de transpeptidación en el producto proteico es de solo siete residuos, de los cuales tres son glicinas.

La estrategia: reacción de transpeptidación mediada por sortasa A. ( A ) La reacción se ejemplifica mediante el acoplamiento de una subunidad BLS (rojo) y el dominio RBD del SARS-Co-V2 (verde). Se muestra la forma intermedia enzimática (RBD unido covalentemente a Sortasa A), así como su posterior hidrólisis para producir el subproducto RBD -Leu-Pro-Glu-Thr. Este último no se puede reutilizar en la reacción de acoplamiento. También se muestra la reacción catalizada por la proteasa TEV para producir Gly-Gly-Gly-BLS, el sustrato de Sortasa A. ( B ) Se muestra un producto de reacción hipotético con una multiplicidad de 10:10 (RBD ₁₀ /BLS ₁₀ ).

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En este trabajo, producimos un RBD-BLS multimérico mediante una reacción de acoplamiento covalente de transpeptidación mediada por sortasa A entre RBD expresado en P. pastoris y BLS producido en E. coli., con el propósito de aumentar la inmunogenicidad de RBD. RBD-BLS indujo una fuerte respuesta humoral contra SARS-CoV-2 RBD. Sorprendentemente, el antígeno RBD produjo una respuesta humoral significativamente mayor cuando se presentó al sistema inmunitario como un multímero RBD-BLS con un alto número de moléculas RBD por partícula (alta multiplicidad) que como un monómero o como partículas RBD-BLS de baja multiplicidad. Por lo tanto, el multímero RBD-BLS es un posible candidato a vacuna, que también puede usarse para producir anticuerpos neutralizantes en sistemas animales. Esta plataforma también podría usarse para presentar simultáneamente varias proteínas al sistema inmunitario, como diferentes variantes de RBD y otros dominios de la proteína espiga.

Producción de sustratos de Sortasa A: BLS en E. coli y RBD en Pichia pastoris

Para obtener un portador multimérico para RBD, primero producimos una forma oligomérica de BLS en E. coli . Para este propósito, sintetizamos y secuenciamos un gen que codifica una variante de proteína transportadora BLS que incluía en su región N-terminal un sitio de escisión de proteasa TEV (en cursiva) seguido de una etiqueta Gly ( Met-Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe -Gln -Gly-Gly-Gly- BLS ) (Fig.  1 ). Esta estrategia permite la eliminación de Met N-terminal después de una digestión cuantitativa con la proteasa TEV, produciendo así un polipéptido que lleva un Gly-Gly-Gly N-terminal requerido para la reacción de transpeptidación mediada por Sortasa A. Después de la expresión de BLS en E. coli, la proteína se purificó en dos pasos, mediante cromatografía de intercambio aniónico (Q-Sepharose) seguida de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC, Superdex S200). La proteína se obtuvo con un alto rendimiento (100 mg L – ¹ , > 98% de pureza), y su identidad se verificó después de la purificación por espectrometría de masas. Luego se digirió BLS con proteasa TEV para generar el motivo Gly-Gly-Gly N-terminal para que pueda funcionar como un sustrato Sortasa A. La digestión se confirmó mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas (Figs. S1 , S2 ), que mostró el esperado transportador multimérico «activado» Gly-Gly-Gly- BLS . Vale la pena mencionar que la digestión TEV de BLS fue completa.

_{Para generar el segundo sustrato de la reacción de} acoplamiento, se produjo en P. pastoris ( RBD-Leu-Pro-Glu-Thr-Gly -(His) ₆ ) y obtenido a partir de sobrenadantes de cultivo con un alto rendimiento (180 mg L – ¹ , > 90% de pureza). Hemos demostrado previamente que esta proteína es conformacionalmente estable e impulsa una respuesta inmune significativa en ratones cuando se administra en una formulación con adyuvantes ²⁵. Evaluamos la estructura terciaria del RBD purificado a través de espectroscopía de CD-UV cercano. Los resultados son compatibles con un entorno asimétrico y rígido de las cadenas laterales aromáticas, lo que indica un empaque nativo (Fig.  2 A, B). Además, la proteína no presenta una agregación significativa, como se infiere de los perfiles SEC-HPLC y la ausencia de especies con bajos volúmenes de elución (Fig.  2 C). Además, como se observó previamente ²⁵ , el análisis SEC-HPLC reveló la existencia de dos especies diferentes (diferentes en sus patrones de glicosilación) con tiempos de elución compatibles con masas moleculares entre 45 y 20 kDa.

La RBD expresada en Pichia pastoris está correctamente plegada y no se agrega. Espectros de dicroísmo circular de UV cercano de RBD purificado: voltaje de alta tensión ( A ) y espectros de CD de UV cercano ( B ). La concentración de proteína fue de 30 µM, en Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4. ( C ) SEC-HPLC de perfiles de elución de RBD (seguidos a 280 nm) correspondientes a dos lotes diferentes (R4 y S4) de RBD expresados ​​y purificados de forma independiente, y de marcadores de masa molecular (158, 44, 17 y 1,35 kDa).

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Acoplamiento mediado por Sortasa A nativa de RBD a un péptido fluorescente

Para evaluar la capacidad de RBD recombinante – Leu-Pro-Glu-Thr-Gly -(His) ₆ para actuar como sustrato de sortasa A, primero llevamos a cabo una reacción preliminar usando la sonda peptídica fluorescente Gly-Gly-Gly-Ser- {Lys- (TMR) } como sustrato en lugar de BLS. Este péptido contiene un marcador de tetrametilrodamina (TMR) unido covalentemente. El producto de esta reacción fue el RBD -Leu-Pro-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(Lys – TMR ) acoplado covalentemente (RBD-TMR).

Después de la reacción de acoplamiento y la separación de SEC (G25), casi el 17 % del RBD de entrada se marcó con la sonda fluorescente, como se deduce del análisis de espectros UV y visible (Fig.  3 A, B). El RBD sin reaccionar retuvo la etiqueta (His) ₆ y, por lo tanto, pudo separarse y recuperarse mediante la adición de resina NTA a la mezcla de reacción seguida de centrifugación. Este procedimiento produjo un rendimiento final de ~ 50% de RBD marcado. Además, el análisis SEC-HPLC, monitorizado a 554 nm, que permite la detección del marcador TMR, reveló la presencia del producto de reacción. Sin embargo, no se observó ningún péptido fluorescente libre en el perfil de elución (Fig.  3C), lo que indica que la matriz G25 fue capaz de separar el péptido libre residual. El análisis del producto de reacción no mostró picos en tiempos de elución cortos, lo que sugiere que RBD-TMR no era propenso a la agregación después del acoplamiento covalente de la sonda. Estos resultados mostraron que Sortasa A era funcional y que era posible realizar el acoplamiento covalente entre RBD recombinante y un sustrato marcado con Gly-Gly-Gly.

Acoplamiento covalente de RBD a una sonda fluorescente mediada por sortasa A. ( A ) espectros de absorción UV y ( B ) visible de la sonda fluorescente libre (azul) y el producto de reacción de acoplamiento RBD-TMR (verde) después de una separación en columna G25. El espectro RBD también se muestra como referencia (rojo) ( C ) Perfiles de elución SEC-HPLC (columna Superose 6) de RBD (controlado a 280 nm, rojo), TMR (controlado a 554 nm, azul) y RBD-TMR ( monitoreado a 554 nm, verde) después del acoplamiento y separación G25.

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Funcionalidad de RBD recombinante

Además del análisis conformacional, también evaluamos la funcionalidad de RBD-TMR purificada. Por lo tanto, probamos su capacidad para unirse al receptor RBD ACE2. Para este propósito, incubamos una mezcla de (a) la proteína marcada (RBD-TMR), (b) una versión soluble de ACE2 con una etiqueta C-terminal (His) ₆ y (c) agarosa-NTA-Ni ^2 + resina (Fig.  4 A) durante 30 min. A continuación, separamos el complejo ternario ACE2/RBD-TMR/agarose-NTA-Ni ^2 + por centrifugación. Dado que la matriz agarosa-NTA-Ni ²⁺ interactúa con el (His) ₆etiqueta que está presente solo en el terminal C de ACE2 (y no en RBD-TMR), la centrifugación tira hacia abajo de la resina unida a ACE2, que a su vez está unida a RBD-TMR. Esto provoca una disminución significativa de la intensidad de fluorescencia del sobrenadante (570–580 nm, Fig.  4 B). La elución del complejo de la matriz NTA mediante la adición de imidazol 300 mM provocó un fuerte aumento de la fluorescencia en la fracción soluble, lo que indica además que ACE2 marcado con  (His) _{6 forma un complejo con RBD-TMR (Fig.} 4 C). Concluimos que RBD-TMR fue capaz de interactuar con el dominio soluble de ACE2, lo que indica que las características estructurales relevantes para la interacción se conservan en RBD recombinante producido en P. pastoris, y que las condiciones empleadas para realizar la reacción de transpeptidación para producir RBD-TMR no afectaron a su estructura terciaria.

Evaluación de la unión de RBD-TMR a ACE2. ( A ) Descenso de RBD-TMR y elución de la matriz. Se inmovilizó ACE2 marcado con (His) _{6 en una matriz de NTA (300 μl de ACE2 0,9 μM + 75 μl de resina de agarosa-NTA-Ni} ²⁺ ). Se realizó una incubación de control omitiendo ACE2. Las muestras se centrifugaron y lavaron tres veces y posteriormente se incubaron en presencia de RBD-TMR 1 μM durante 30 min con agitación suave. Creado con BioRender.com. ( B ) Después de la centrifugación, el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se analizó mediante espectroscopia de fluorescencia. ( C) La matriz se lavó tres veces y se eluyó con 300 μL de Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM e imidazol 250 mM. La muestra se centrifugó y el sobrenadante se analizó mediante espectroscopia de fluorescencia. En ( B , C ) las líneas negras corresponden a la incubación en presencia de ACE2, mientras que las líneas rojas corresponden a los controles sin ACE2. La longitud de onda de excitación fue de 550 nm, los anchos de banda tanto de excitación como de emisión fueron de 5 nm. Todas las mediciones se realizaron a 25 °C.

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Acoplamiento mediado por sortasa A nativa de RBD a BLS

Dado que el RBD recombinante demostró ser un buen sustrato de Sortasa A, intentamos el acoplamiento de RBD -Leu-Pro-Glu-Thr-Gly-(His) ₆ y Met-Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe- digerido con TEV. Gln-Gly-Gly-Gly-BLS. El producto esperado era el RBD -Leu-Pro-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly- BLS acoplado covalentemente (RBD-BLS en la Fig.  1 ). Los perfiles de SEC-HPLC (columna Superose 6) correspondientes a un multímero BLS, RBD solo y el producto de reacción se muestran en la Fig.  5A. El producto del acoplamiento covalente mediado por Sortasa A exhibió un tiempo de elución compatible con un incremento en el radio hidrodinámico del ensamblaje en comparación con el observado para el BLS decámero (27 y 31.5 min, respectivamente). El decámero BLS sin reaccionar y el RBD también se distinguen claramente en el perfil SEC.

Acoplamiento covalente mediado por sortasa A de RBD y BLS. ( A ) Los perfiles SEC-HPLC corresponden a Gly-Gly-Gly-BLS (negro), RBD (rojo), la mezcla de reacción de control sin Sortasa A (violeta) y el producto de la reacción catalizada por Sortasa A, (verde, inferior panel). Se cargó un volumen equivalente de una solución de EDTA 10 mM, CaCl2 10 mM _como control (magenta, panel inferior). El BLS decamérico tiene un peso molecular de aproximadamente 170 kDa, y cada subunidad RBD agrega aproximadamente 26 kDa o 40 kDa (excluyendo o incluyendo la glicosilación, respectivamente). La multiplicidad observada fue ~ 6.6 (RBD _6.6 /BLS ₁₀) con un rendimiento de ~ 30% con respecto a la masa RBD inicial. El oligómero RBD-BLS eluyó a ~ 25 min. El pico observado alrededor de los 38-43 min corresponde a EDTA-Ca ²⁺ . Dado que Sortasa A requiere CaCl ₂ 10 mM para la activación de su actividad catalítica, se añadió EDTA 10 mM para detener la reacción, la cual se llevó a cabo durante 240 min a 4 °C. ( B ) Análisis SDS-PAGE del acoplamiento RBD-BLS mediado por sortasa A. Para facilitar la detección de los productos de reacción de Sortasa A, las muestras de proteínas se trataron o no con endoglicosidasa H. Carriles 1–2: RBD + BLS sin sortasa A, desglicosilada (carril 1) o no (carril 2), Carriles 3– 4: RBD + BLS en presencia de Sortasa A, desglicosilada (carril 3) o no (carril 4). La imagen completa de la SDS-PAGE se encuentra en el material complementario, figuraS5 .

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Dado que BLS es una proteína decamérica, los productos de transpeptidación son heterogéneos en condiciones no saturadas. Se pueden obtener diferentes multiplicidades de moléculas de RBD por decámero (RBD _n /BLS ₁₀ ) dependiendo de la proporción de sustratos utilizados en la reacción de Sortasa A. Utilizamos concentraciones bajas de RBD y altas de BLS para obtener multiplicidades bajas (entre 1 y 2 copias de RBD por multímero, Fig. S3 , denominadas RBD-BLS LM), mientras que las multiplicidades más altas (denominadas RBD-BLS HM) se obtuvieron con relaciones RBD/BLS más altas (Fig. S3 , Fig.  5A ).

Los análisis SEC-HPLC y SDS-PAGE de BLS, RBD y RBD-BLS presentes en la mezcla de reacción antes y después de la adición de sortasa A nos permitieron cuantificar el rendimiento de la reacción de acoplamiento y la multiplicidad de los productos (Fig. S4 ), que es el número promedio de copias RBD por partícula RBD-BLS.

La presencia de tamaños heterogéneos de fracciones de glucano en RBD dio como resultado una alta heterogeneidad que complica el análisis. Por lo tanto, recortamos los glicanos con endoglicosidasa H y resolvimos los productos desglicosilados de la reacción de acoplamiento mediante SDS-PAGE (Fig.  5 B, comparación de carriles 1 y 3 con 2 y 4). La banda nítida que migra cerca del marcador de 40 kDa en el carril 3 corresponde al RBD-BLS acoplado covalentemente (26 kDa de RBD desglicosilado + 17 kDa de BLS monomérico, 43 kDa, carril 1). Cabe señalar que una gran cantidad de RBD aún permanece desacoplada (flecha azul en el carril 3), por lo que aún se debe mejorar la eficiencia de la reacción. Además, se observó un subproducto (alrededor de 15 a 18 kDa) que aún debe identificarse (carriles 3 y 4).

En condiciones discontinuas, en presencia de doble exceso molar de RBD respecto a BLS, obtuvimos rendimientos de 10-20% de acoplamiento de RBD con respecto a la cantidad total de RBD utilizada, dando lugar a complejos con multiplicidades medias entre 2 y 4 ( RBD ₂ /BLS ₁₀ y RBD ₄ /BLS ₁₀ , respectivamente) en experimentos preliminares. Sin embargo, la incorporación de un paso de concentración (con una unidad de filtro centrífugo Centricon de corte de 10 kDa) nos permitió mejorar el rendimiento de la reacción, obteniendo multiplicidades más altas (entre RBD _6. /BLS ₁₀ y RBD _7. /BLS ₁₀, RBD-BLS HM, con un rendimiento de ~ 30% con respecto a la masa RBD inicial). Se puede lograr un aumento adicional en el acoplamiento de RBD aumentando la concentración de BLS, aunque a expensas de disminuir la multiplicidad del producto final. La saturación de BLS con RBD fue difícil de lograr debido al equilibrio intrínseco de la reacción de acoplamiento.

En resumen, logramos acoplar el antígeno RBD producido en eucariotas con el BLS portador decamérico expresado en E. coli en condiciones nativas. Además, la posibilidad de obtener RBD-BLS con diferentes multiplicidades nos permitió estudiar el efecto de este parámetro en la elicitación de la respuesta inmune.

Una vez purificado por SEC, se encontró que el producto de acoplamiento era estable después de la congelación y posterior descongelación, y no mostró ninguna tendencia significativa a la agregación. Además, el producto podía concentrarse fácilmente y no mostraba ninguna interacción aparente con las membranas del concentrador (datos no mostrados). Es importante destacar que los productos de acoplamiento también se separaron de la enzima Sortasa A mediante SEC. Este es un paso esencial para evitar la transpeptidación inversa y la hidrólisis de RBD-Sortasa A (que daría como resultado un producto RBDh que la enzima no puede reciclar) ²⁶ , lo que reduciría el rendimiento global de la reacción.

La inmunogenicidad de RBD aumenta al acoplarse a un multímero BLS

Para evaluar si RBD acoplado a BLS puede mejorar la inmunogenicidad de RBD, inmunizamos ratones con dos dosis separadas por 30 días de 15 μg que contenían RBD acoplado o desacoplado a BLS en diferentes multiplicidades, es decir, RBD-BLS HM RBD-BLS LM y RBD monomérico (Tabla 1 , “ Materiales y métodos ”). Las formulaciones de RBD y RBD-BLS-HM se adyuvaron o no con Al(OH) ₃ .

La formulación multimérica RBD-BLS HM (RBD _6.6 /BLS ₁₀ ) provocó una fuerte respuesta humoral con títulos altos de IgG anti-RBD (82 000 ± 28 000), que aumentaron ~ 7 veces adicionales cuando se adyuvaron con Al(OH) ₃ (553 000 ± 366.000) (Fig.  6 ). Por el contrario, el RBD monomérico no provocó una respuesta significativa de anticuerpos específicos de IgG anti-RBD incluso en presencia de Al(OH) ₃ . Sorprendentemente, una formulación que contiene 40 μg de RBD monomérico por dosis en presencia de Al(OH) ₃) no dio como resultado un aumento significativo de la respuesta de anticuerpos específicos de IgG (datos no mostrados). El grupo RBD + BLS en el que los ratones fueron inmunizados con BLS junto con RBD monomérico (es decir, no acoplado covalentemente), cada uno a la misma concentración que se usó para inmunizar al grupo RBD-BLS HM, no mostró ninguna diferencia significativa en comparación con el grupo inmunizado con RBD solo. Este resultado indica que BLS debe acoplarse covalentemente al RBD para mejorar su respuesta inmunológica. Además, la multiplicidad de multímeros RBD-BLS resultó ser una variable clave, ya que una multiplicidad alta provocó una fuerte respuesta inmune, mientras que una multiplicidad baja no (grupo RBD-BLS LM, entre 1 y 2 copias de RBD por multímero). Cabe mencionar que la formulación RBD-BLS LM incluía la misma masa de RBD (15 µg/dosis),vs. 17 µg BLS/dosis para los grupos RBD-BLS HM y RBD + BLS, Tabla 1 ).

Respuesta inmune humoral específica de RBD en ratones vacunados con multímeros RBD monoméricos y RBD-BLS. ( A ) Esquema de inmunización y recolección de sangre. Se vacunaron ratones BALB/c (n = 5) con dos dosis de las formulaciones con 30 días de diferencia por vía subcutánea y se obtuvieron sueros 20 días después del refuerzo. Creado con BioRender.com. ( B ) Evaluación de los títulos de anticuerpos IgG anti-RBD. Se dispensaron diluciones en serie de muestras de suero en una placa de múltiples pocillos y se determinaron los títulos de IgG específica de RBD mediante ELISA el día 50. La adición o no de 500 μg de Al(OH) ₃está indicado el adyuvante. Los resultados se expresan como títulos de punto final medios. El grupo RBD + BLS fue co-inmunizado con BLS y RBD a la misma concentración que se usó en el grupo RBD-BLS HM, pero no acoplado. Control y PreIS corresponden a ratón normal y suero preinmune, respectivamente. El SEM se indica mediante líneas verticales. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p < 0,05 (*, prueba t de Student). Los puntos negros muestran los valores individuales correspondientes al título de IgG específico de RBD.

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Estos resultados muestran claramente que el acoplamiento de RBD a BLS en alta multiplicidad mejora fuertemente la inmunogenicidad de RBD, lo que puede deberse al menos en parte a la disposición espacial de las subunidades de RBD en las partículas resultantes (Fig.  1 B).

La inmunización con RBD-BLS provoca anticuerpos con actividad neutralizante contra una transducción de virus pseudotipado SARS-CoV-2 S

Para analizar la actividad neutralizante de los sueros inmunes provocados por la inmunización con RBD-BLS, se realizaron ensayos de neutralización in vitro utilizando lentivirus pseudotipados SARS-CoV-2 S ²⁷ . Se realizaron diluciones en serie de sueros en el medio DMEM y se incubaron con cantidades iguales de virus pseudotipado, luego se agregaron a células HEK-293T previamente transfectadas con proteasa ACE2 y TMPRSS2. Mientras que las partículas de virus pseudotipadas fueron capaces de entregar ARN codificante de GFP en las células en presencia de suero preinmune, los sueros inmunes impidieron la transducción, que se muestra como un porcentaje de inhibición, de una manera dependiente de la concentración. Los sueros de ratones inmunizados con RBD-BLS HM (Tabla 1 ), redujeron fuertemente el número de células que expresan GFP (Fig.  7). Sorprendentemente, las inmunizaciones con RBD-BLS HM administradas en presencia o ausencia de adyuvante Al(OH) ₃ dieron como resultado títulos altos de anticuerpos neutralizantes (Fig.  7 , valores IC ₅₀ de 1816, con adyuvante, y 1503, sin adyuvante), según lo juzgado por la reducción significativa observada en la transducción de virus pseudotipados. Por el contrario, los sueros de ratones inmunizados con el dominio RBD expresado por Pichia pastoris más BLS (no acoplado covalentemente) dieron como resultado títulos de anticuerpos neutralizantes significativamente más bajos (IC50 ₌  17, Tabla 1 , RBD + BLS). En conjunto, estos resultados muestran que RBD-BLS HM es un candidato muy prometedor tanto para inducir anticuerpos neutralizantes en modelos animales .

Ensayo de neutralización del virus pseudotipado SARS-CoV-2 S. ( A ) Esquema del ensayo. Las células HEK-293T transfectadas con la proteasa ACE2 y TMPRSS2 se transdujeron con un lentivirus pseudotipado SARS-CoV-2 S que lleva un ARNm que codifica GFP en presencia de diferentes diluciones de sueros de ratón. Cuarenta y ocho horas después, se observaron las células bajo el microscopio. Creado con BioRender.com. ( B ) Se determinó el número de células positivas para GFP para cada dilución en serie. La dilución de anticuerpos séricos que causa una reducción del 50 % de las células positivas para GFP (IC ₅₀ ) en comparación con las células tratadas con el control “solo con virus” se calculó utilizando Graphpad Prism. PreIS corresponde a los sueros preinmunes.

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Hace un año, justo antes de que se detectara por primera vez el SARS-CoV-2 en Argentina, un grupo de investigadores de diferentes instituciones y con diferentes conocimientos relevantes se unieron para ayudar a combatir la pandemia en curso. Nuestro trabajo tuvo como objetivo producir el dominio RBD de la proteína de punta del SARS-CoV-2, ya que es una herramienta útil para la detección serológica de pacientes infectados y tiene el potencial de ser utilizado como antígeno para desarrollar una vacuna de bajo costo. Hasta ahora hemos producido con éxito RBD en diferentes sistemas de expresión, entre ellos en la levadura P. pastoris, que mostró propiedades biofísicas similares a las de RBD expresado en células de mamíferos ²⁵ .

En este trabajo, RBD se acopló covalentemente a un transportador multimérico con el objetivo de mejorar su inmunogenicidad para desarrollar un nuevo candidato a vacuna. Como portador, utilizamos la proteína lumazina sintasa multimérica de Brucella abortus (BLS), que previamente se ha demostrado que es un buen portador de antígenos para la inmunización sistémica y como adyuvante de la mucosa, lo que lo convierte en un buen candidato para ser utilizado en vacunas de subunidades orales. ¹⁷ _ Hemos mejorado la eficiencia de la reacción de acoplamiento RBD-BLS para escalar la producción y purificación del oligómero RBD-BLS, obteniendo diferentes multiplicidades (1–6) y comparando la inmunogenicidad de RBD-BLS vs. RBD en ratones.

Nuestros resultados mostraron que el multímero RBD-BLS puede provocar una mayor respuesta inmune en comparación con el RBD monomérico, incluso en ausencia de un adyuvante. Este aumento dependía del acoplamiento covalente de RBD a BLS, ya que la administración conjunta de RBD con BLS (es decir, sin acoplamiento covalente) no indujo una respuesta inmunitaria equivalente. También observamos que la multiplicidad de RBD acoplada a BLS fue un factor importante en la mejora de la respuesta inmunológica. En estudios inmunológicos observamos que RBD acoplado a BLS en una multiplicidad alta (6-7 copias de RBD por decámero de BLS) es notablemente más inmunogénico que RBD monomérico, o que RBD acoplado a BLS en una multiplicidad baja (1-2 copias de RBD por BLS). decámero). Se observó un aumento significativo en la respuesta inmune humoral anti-RBD cuando los ratones fueron inmunizados con RBD-BLS HM en comparación con RBD monomérico. Por el contrario, RBD monomérico no provocó una respuesta inmune humoral significativa en presencia o ausencia de Al (OH)₃ , o por la adición de BLS a RBD (sin acoplamiento covalente).

Mientras que el BLS es altamente resistente al despliegue inducido por la urea, su estructura decamérica es sensible a un pH bajo (pH 4,0-5,5) o a concentraciones moderadas de cloruro de guanidinio (2,0 M) ²⁸ , que provocan la disociación de las formas decaméricas en pentámeros. Además, existen variantes diseñadas por BLS con mutaciones en la interfaz pentámero-pentámero que permiten la producción de decámeros heteropentaméricos polarizados ²⁹ . Esto hace que BLS sea una proteína muy maleable, lo que podría permitir, por ejemplo, incluir diferentes inmunógenos en una sola partícula de proteína. Los oligómeros de BLS que llevan diferentes proteínas acopladas podrían desarmarse mediante incubación a pH bajo, mezclarse y volver a ensamblarse para generar una diversidad de homo y heterodecámeros.

Es interesante que RBD-BLS (HM) indujera una respuesta de anticuerpos significativa incluso sin adyuvante. Se ha informado previamente que BLS induce la activación de células dendríticas de manera dependiente de TLR4 en ausencia de adyuvantes. También se ha probado la capacidad de varias quimeras BLS para activar células dendríticas ²⁰ . Como agonista del receptor tipo Toll (TLR), se ha demostrado que el BLS puede estimular tanto la respuesta inmunitaria innata como la adaptativa, mejorando así la eficacia de la vacuna ^17 , 20. Por lo tanto, las partículas RBD-BLS, solas o en combinación con adyuvantes, tienen el potencial de impulsar las respuestas de las células T y B contra el SARS-CoV-2, a través de mecanismos que merecen una mayor exploración. Aún no se ha realizado un análisis detallado de los perfiles de inmunoglobulinas obtenidos, la respuesta celular y los experimentos de desafío para afirmar una protección a largo plazo contra la infección por Sars-CoV-2.

Otros grupos han considerado la idea de acoplar RBD a una proteína multimérica para producir un inmunógeno más fuerte. Se han propuesto algunas plataformas moleculares para multimerizar antígenos de CoV. Un trabajo reciente muy interesante informa sobre la producción de partículas que muestran regiones de la proteína de pico del coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV), acoplando su dominio RBD a una lumazina sintasa (LS) multimérica, utilizando el sistema SpyTag/SpyCatcher ³⁰ , en en el que el péptido SpyTag que incluye 13 aminoácidos reacciona con la proteína SpyCatcher de 12,3 kDa ^31 , 32 . El sistema SpyTag/SpyCacther se utilizó recientemente para la construcción de una vacuna RBD contra el SARS-CoV-2 basada en nanopartículas de ferritina ³³. Zhang y sus compañeros de trabajo desarrollaron recientemente una estrategia similar para la proteína espiga del SARS-CoV-2 utilizando tanto Aquifex aeolicus LS como ferritina de Helicobacter pylori como andamios de nanopartículas ³⁴ . Combinaron una versión trimérica del antígeno con LS, lo que provocó que dichas nanopartículas produjeran respuestas de anticuerpos neutralizantes significativamente más altas que la proteína espiga sola. Las nuevas estrategias para desarrollar nuevas vacunas contra el SARS-CoV2 también incluyen proteínas de fusión autoensambladas. Por ejemplo, Powell y sus colaboradores prepararon recientemente en células de mamífero Expi293F una proteína de fusión que contiene el ectodominio de espiga seguido de ferritina de H. pylori , una proteína de 19 kDa que se autoensambla en una nanopartícula de 24 subunidades ³⁵. Cabe destacar que estas nanopartículas muestran ocho copias de un antígeno trimérico en la superficie, como se usó anteriormente para la hemaglutinina del virus H1N1 ³⁶ . Los autores demostraron que la presentación multivalente de trímeros de punta en ferritina puede aumentar notablemente la obtención de anticuerpos neutralizantes en ratones después de una dosis única.

Se están aplicando varias tecnologías para el desarrollo de vacunas contra el SARS-CoV-2. Estas incluyen tecnologías de vacunas de ARNm, vectores virales no replicantes, subunidades de proteínas y virus inactivados, que han demostrado ser seguras y eficientes con una eficacia reportada entre 50 y 95% ³⁷. El uso de ARNm y adenovirus es relativamente nuevo en comparación con el de las vacunas basadas en proteínas, que es una tecnología probada desde hace mucho tiempo. Los ensayos clínicos para las vacunas de subunidades de proteínas basadas en SARS-COV2 RBD demostraron que son seguras y que provocan respuestas inmunitarias aceptables. Además, no requieren temperaturas de almacenamiento muy bajas, lo que puede representar una limitación importante para los países en desarrollo con recursos limitados para mantener los suministros de la cadena de frío. Sin embargo, a menudo no logran provocar respuestas inmunitarias potentes y duraderas, y deben formularse con adyuvantes potentes. Los antígenos multivalentes acoplados a nanopartículas han demostrado tener una mayor eficacia a una dosis más baja que las vacunas tradicionales de subunidades de proteínas. Aquí demostramos que la conjugación de RBD a BLS en alta multiplicidad puede aumentar significativamente la inmunogenicidad de RBD, incluso en ausencia de adyuvantes. En comparación con otros antígenos multivalentes, el acoplamiento de transpeptidación mediado por sortasa A utilizado para producir RBD-BLS deja solo una cicatriz proteica mínima de solo siete residuos, de los cuales tres son glicinas. Las vacunas multiantígenas podrían ser mejores para la protección contra las variantes del virus. El diseño modular de la nanopartícula RBD-BLS permitiría la fácil administración de nuevas variantes de antígeno combinadas en la misma partícula. Aunque esta es una estrategia prometedora, el rendimiento de la reacción de acoplamiento aún es limitado y afecta la multiplicidad y homogeneidad del producto. Sería necesario reducir la complejidad del proceso de producción y aumentar el rendimiento de la reacción de conjugación para escalar la producción de antígeno. En este contexto, la estrategia presentada aquí que involucra partículas RBD-BLS puede considerarse como una nueva herramienta útil contra el SARS-CoV-2. La plataforma es lo suficientemente dúctil para incorporar nuevas variantes como E484K, que se ha asociado con el escape de anticuerpos neutralizantes.^{38 , 39 , 40} o N501Y, que se asocia con una mayor especificidad de unión y linajes de crecimiento más rápido ⁴¹ .

Expresión y purificación de la proteína SARS-CoV-2 RBD

El dominio de unión al receptor de la proteína espiga del SARS-CoV-2 (RBD) se expresó en Pichia pastoris . La secuencia de codificación de RBD (residuos de aminoácidos de punta 319–537) se fusionó con la señal de secreción del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae (N-terminal) seguida de una secuencia de reconocimiento de Sortasa A C-terminal y una etiqueta His ₆ (C-terminal) dada la Secuencia C-terminal RBD -Leu-Pro-Glu-Thr-Gly-(His) ₆ como se informó previamente ²⁵ . La expresión se realizó en un biorreactor como se indica, y la proteína se purificó con un rendimiento de 150 mg L- ¹ de sobrenadante de cultivo ²⁵. La concentración de RBD se determinó por espectrofotometría UV utilizando un coeficiente de absorción de 33.850 M- ¹  cm – ¹ .

Expresión y purificación de BLS

Un gen que codifica una variante de lumazina sintasa de Brucella abortus (BLS) que incluye un sitio TEV N-terminal seguido de una secuencia Gly-Gly-Gly y un espaciador Gly-Ser-GLy-Ser-GLy (Met-Glu-Asn-Leu -Tyr-Phe-Gln-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-GLy-Ser-Gly- BLS ) se ensambló y clonó en el vector pET11a (Novagen). La construcción se comprobó mediante secuenciación. La proteína se expresó en E. coli BL21(DE3). Las células se cultivaron en caldo Luria Bertani a 37 ºC a OD ₆₀₀1.0, y la expresión de proteínas se indujo con IPTG 1 mM. La expresión se llevó a cabo a 28 ºC durante la noche. Las células se recolectaron por centrifugación a 6000 rpm durante 20 min y se congelaron a -20 ºC hasta su uso. El sedimento celular se resuspendió en 20 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 7,4 y se sonicó suavemente en un baño de agua con hielo. La muestra se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min y la fracción soluble se transfirió a un tubo nuevo. La proteína se purificó en dos pasos. Primero se cargó la fracción soluble en una columna cromatográfica de intercambio aniónico (Q-Sepharose, dado que el valor teórico de pI de BLS es 6,4). Las fracciones que contenían BLS, a juzgar por el análisis SDS-PAGE, se combinaron y cargaron en una columna cromatográfica de exclusión por tamaño (Superdex S200). Las fracciones que contenían BLS se agruparon y la proteína purificada se analizó mediante espectrometría de masas y SDS-PAGE. La concentración de BLS se determinó mediante espectrofotometría UV utilizando un coeficiente de absorción de 18.405 M⁻¹  cm ⁻¹ .

Expresión y purificación de ACE2

El plásmido de expresión pcDNA3-sACE2(WT)-8his, que incluye el gen codificante del dominio soluble ACE2 humano (residuos 1–615), seguido de un conector Gly-Ser-Gly y ocho residuos His para la purificación, se transfectó en HEK-293T células mamíferas. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco con alto contenido de glucosa (4,5 g L- ¹ ) (DMEM, Thermo Fisher Scientific) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS, Natocor), 110 mg L – ¹ de piruvato de sodio (Thermo Fisher Scientific) y penicilina/estreptomicina (100 unidades mL – ¹ y 100 μg mL- ¹ respectivamente, Thermo Fisher Scientific) en una incubadora a 37 °C bajo 5% _de CO2 . Las células se sembraron (2 × 10 ⁷células por placa de 150 mm) y cultivadas durante 24 h antes de la transfección con polietilenimina (PEI, Sigma). Después de 72 h, el medio de cultivo celular se centrifugó dos veces a 12 000 × g durante 20 min a 4 °C. El pH del sobrenadante se ajustó a pH 8,0 con un tampón de equilibrio (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM e imidazol 20 mM, pH 8,0). La ACE2 soluble se purificó usando una columna de Ni ²⁺ -NTA-agarosa previamente equilibrada. La proteína se eluyó aumentando las concentraciones de imidazol (preparado en el tampón de equilibrio). Las fracciones que contenían ACE2, a juzgar por el análisis SDS-PAGE, se agruparon y dializaron frente a un tampón sin imidazol (fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4). pcDNA3-sACE2(WT)-8his fue un obsequio de Erik Procko (Addgene plásmido n.° 149268;http://n2t.net/addgene:149268 ; RRID:Addgene_149268) ⁴² , y la línea celular de mamífero HEK-293T fue proporcionada amablemente por Xavier Saelens (VIB-Universidad de Gante, Bélgica). La concentración de ACE2 se determinó mediante espectrofotometría UV utilizando un coeficiente de absorción de 157.220 M- ¹  cm – ¹ .

Expresión y purificación de la proteasa TEV

La proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) fue un regalo de Helena Berglund (Addgene plásmido n.° 125194; http://n2t.net/addgene:125194 ; RRID:Addgene_125194) ⁴³ . Brevemente, se cultivaron células E coli Rosetta (DE3) (empezando con una dilución 1/20 de un precultivo durante la noche) en medio Luria Bertani a 37 °C hasta una DO _{600 nm} de 0,6. Se indujo TEV (durante 4 ha 37 °C) mediante la adición de IPTG 0,5 mM. Las células se centrifugaron, resuspendieron y sonicaron en 20 ml de tampón de lisis (fosfato 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, imidazol 20 mM, glicerol al 10%). Posteriormente se centrifugó la muestra y se cargó la fracción soluble en un NTA-Ni ^2 +columna de agarosa previamente equilibrada con el tampón de lisis. Se realizó un paso de lavado con 10 volúmenes de columna y la proteína se eluyó con 2,5 volúmenes de tampón de elución (fosfato 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, imidazol 250 mM, glicerol al 10%). Finalmente, para eliminar el imidazol, la proteína se sometió a diálisis y se almacenó a -80 °C en pequeñas fracciones.

Sortasa A expresión y purificación

El pentamutante Sortase A (eSrtA) en pET29 fue un regalo de David Liu (Addgene plásmido # 75144; http://n2t.net/addgene:75144 ; RRID:Addgene_75144) ⁴⁴ . Brevemente, se cultivaron células de E. coli BL21 (DE3) (empezando con una dilución 1/40 de un precultivo durante la noche) en Terrific Broth a 37 °C hasta una DO _{600 nm} de 0,6. Se indujo la expresión de sortasa A durante 5 ha 37 °C mediante la adición de IPTG 1 mM. Las células se centrifugaron, resuspendieron y sonicaron en 35 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, imidazol 20 mM, glicerol al 10 %). Posteriormente se centrifugó la muestra y se cargó la fracción soluble en NTA-Ni ²⁺agarosa previamente equilibrada con el tampón de lisis. Se realizó un paso de lavado con 10 volúmenes de columna y la elución se llevó a cabo con 2,5 volúmenes de tampón de elución (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, Imidazol 350 mM, glicerol al 10%). Finalmente, se eliminó el imidazol y la proteína se concentró utilizando un Centricon (Merck Millipore) y se conservó a -80 °C en pequeñas fracciones a una concentración de 2 mM.

ESI MS para análisis de masa intacta

Las muestras de proteínas se analizaron en una plataforma LC-ESI-MS que consta de un sistema de bomba Surveyor MS (columna C4, Higgins Analytical Proto 300 5 µm RS-0301-W045, 30 mm × 1,0 mm) acoplado a un espectrómetro de masas por electrospray (Thermo Finnigan LCQ duo, equipado con un analizador de masas con trampa de iones). El gradiente fue 5 % de solvente B (96 % de acetonitrilo, 2 % de ácido acético) en solvente A (2 % de acetonitrilo, 2 % de ácido acético) durante 2 min, 5–100 % de solvente B en solvente A en 4 min y 100 % disolvente B durante 8 min a un caudal de 40 μL min- ¹ . El software ProMass Deconvolution Software (Novatia) desconvolucionó los espectros ESI al dominio de carga cero utilizando un conjunto de parámetros estándar: tipo de masa promedio, tolerancia de masa 0,02 %, tolerancia mínima 2 Da y rango de entrada m/z 500–2000 unidades.

Espectroscopia de dicroísmo circular

Las mediciones de los espectros de CD se llevaron a cabo a 20 °C con un espectropolarímetro Jasco J-815. Los espectros de CD de UV cercano se recogieron utilizando células con longitudes de paso de 1,0 cm. El voltaje de alta tensión se registró simultáneamente. Los datos se adquirieron a una velocidad de exploración de 20 nm min – ¹ (se promediaron cinco exploraciones, se promediaron las exploraciones correspondientes a la solución tampón y se restaron de los espectros). Los valores de elipticidad se convirtieron a elipticidad molar.

Sonda fluorescente

El péptido marcado con tetrametilrodamina (TMR) con la secuencia Gly-Gly-GLy-Ser-{Lys-(TMR)} se adquirió de Genscript. Su masa, determinada por el análisis de espectrometría de masas, y los espectros de excitación y emisión eran compatibles con los valores teóricos predichos. Se utilizó un coeficiente de absorción de 87.500 M- ¹  cm – ¹ a 560 nm para calcular la concentración de TMR en solución. Para evaluar la eficacia de transpeptidación, se sustrajo un espectro de TMR libre del espectro de proteína para corregir el valor de absorbancia de 280 nm de la solución de proteína.

Transpeptidación y multiplicidad

La reacción de transpeptidación fue realizada por la enzima Sortasa A. Para obtener un producto con alta multiplicidad (6:10, RBD:BLS) se utilizaron 70 y 35 µM de RBD y BLS respectivamente. Para proporciones más bajas (aproximadamente 2:10, RBD:BLS), se usaron 70 y 350 µM de RBD y BLS respectivamente. La reacción se inició mediante la adición de Sortasa A (concentración final de 0,4 µM de una solución madre 2 mM conservada a -80 °C). La reacción se realizó en un tampón Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, CaCl2 10 _mM . CaCl2 _{_}permitió la activación de Sortasa A, por lo que la reacción se detuvo mediante la adición de EDTA 10 mM. La reacción previamente tratada o no con 5 mU de endoglicosidasa H durante 1 h a 37 °C se analizó por SDS-PAGE y por SEC-HPLC. Con el fin de mejorar la eficiencia y la irreversibilidad de la reacción de transpeptidación, uno de los productos de la reacción, el péptido corto Gly-His-His-His-His-His-His, escindido por Sortasa A del C-terminal de RBD (Fig.  1 como referencia), se extrajo de la mezcla. Para ello, realizamos la reacción en un concentrador de corte de 10 kDa bajo centrifugación a 3000 rpm a 4 °C. Los experimentos de control se realizaron sin centrifugación. Todas las muestras se mantuvieron a 4 °C.

Comportamiento hidrodinámico de las proteínas.

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) se llevó a cabo utilizando una columna Superose-6 (GE Healthcare). La concentración de proteína fue de 10 a 30 μM, normalmente se inyectó un volumen de 50 μL y el tampón de ejecución fue Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH 7,0. El experimento se llevó a cabo a temperatura ambiente ( ∼ 25 °C) a un caudal de 0,5 mL min – ^{1 .} Se usó un instrumento JASCO HPLC. Estaba equipado con un inyector automático, una bomba cuaternaria y un UV-VIS UV-2075 (se monitoreó la elución a 280 nm).

Interacción entre RBD recombinante y ACE2

Se estudió la interacción entre el producto acoplado covalentemente RBD-TMR y el dominio soluble de ACE2 aprovechando la presencia de una etiqueta (His) _{6 en el extremo C terminal de ACE2, que no está presente en RBD-TMR.} ACE2 (1,0 μM) y RBD-TMR (1,0 μM) se incubaron durante 30 min, con agitación suave en la oscuridad en presencia de NTA-Ni ²⁺en fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,40. El complejo se separó de la RBD-TMR libre mediante centrifugación (1 min a máxima velocidad en una microcentrífuga). La fluorescencia después de la incubación se midió utilizando una longitud de onda de excitación de 560 nm, la emisión se controló entre 570 y 670 nm, se utilizó un ancho de banda de 4 nm tanto para la excitación como para la emisión. Las mediciones se realizaron en un espectrofluorómetro JASCO equipado con un portaceldas termostatizado conectado a un baño de agua circulante ajustado a 25 °C. Se utilizó una celda de longitud de camino de 0,3 cm. Además, el complejo unido a la matriz NTA se eluyó mediante la adición de imidazol y la fluorescencia del sobrenadante se analizó de la misma manera.

Eliminación y detección de endotoxinas

El lipopolisacárido (LPS) ⁴⁵ se eliminó de las preparaciones de proteínas mediante una incubación durante la noche (4 °C) de las proteínas con matriz de polimixina B seguida de una segunda incubación (2–3 h) a temperatura ambiente. La matriz se equilibró previamente en solución tampón Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0. Medimos el contenido de LPS de las preparaciones de RBD-BLS purificadas como se describió anteriormente ¹⁹. La concentración de endotoxinas en las muestras de proteína fue determinada por los Laboratorios de la Fundación Cassará. En resumen, todas las muestras de proteínas se llevaron a un volumen final de 200 μL y el contenido de LPS se midió utilizando un kit comercial de Charles River Endosafe (R160), basado en el método cromogénico del ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), con una sensibilidad de 0,015 UE/mL. No se detectó LPS en la preparación de RBD-BLS después de la eliminación de endotoxinas.

Protocolos de vacunación

La inmunización de los ratones fue realizada por expertos del Servicio Tecnológico de Alto Nivel del CONICET (STAN No. 4482), bajo lineamientos del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL). Los ratones BALB/c se obtuvieron del animalario de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de La Plata (Argentina) y se alojaron en el animalario del Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein, Fundación Pablo Cassará. Seis grupos de cinco ratones hembra (6-8 semanas) (n = 5) fueron inmunizados por vía subcutánea con la misma cantidad de proteína RBD (15 µg) acoplada o no a BLS en presencia o ausencia de 500 µg de hidróxido de aluminio (Al (OH) ₃ ). Se obtuvieron dos formulaciones de acoplamiento BLS diferentes (Tabla 1 ): RBD _6.6 /BLS₁₀ (alta multiplicidad, RBD-BLS HM) y RBD _1,5 /BLS ₁₀ (baja multiplicidad, RBD-BLS LM). Además, la formulación de RBD + BLS no acoplada (RBD + BLS, Tabla 1 ) se probó con las mismas condiciones equimolares utilizadas para el grupo RBD-BLS HM. Los sueros preinmunes también se recogieron antes de comenzar la inmunización. Los ratones recibieron dos inmunizaciones con la misma dosis en los días 0 (cebado de antígeno) y 30 (refuerzo de antígeno). A los animales de control adicionales se les inyectaron 500 µg de Al(OH) ₃ por ratón con el mismo programa de inmunización.

Se obtuvieron muestras de sangre 20 días después de la segunda inmunización mediante venopunción de la vena facial. Después de la coagulación a temperatura ambiente durante 1-2 h, las muestras de sangre se centrifugaron a 3000 rpm/min durante 10 min a 4 °C. La capa superior de suero se recogió y almacenó a -20 °C.

Identificación de anticuerpos séricos contra la proteína RBD en ratones usando un ensayo ELISA

La respuesta de anticuerpos contra RBD y RBD-BLS se midió utilizando un procedimiento ELISA estándar. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos de fondo plano (Thermo Scientific NUNC-MaxiSorp) con proteína RBD recombinante producida en P. pastorisa una concentración final de 1 μg/ml (100 μl/pocillo) en tampón de recubrimiento de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4) a 4 °C durante la noche. Después del bloqueo (8% de PBS de leche desnatada en polvo durante 2 horas a 37 °C), las placas se lavaron 5 veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (PBST). Los sueros de ratón diluidos en serie se incubaron a 37 °C durante 90 min en PBS que contenía leche descremada en polvo al 1 % (solución de bloqueo), y las placas se lavaron posteriormente con PBST. Para la determinación de IgG específica total, el anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) IgG (DAKO P0447) se diluyó 1/1000 en una solución de bloqueo y se agregó a los pocillos. Después de incubar durante 1 h a 37 °C, las placas se lavaron cinco veces con PBST y se revelaron con 3,3′,5,5′-tetrametilbifenildiamina (TMB) durante 15 min. La reacción se detuvo con 50 µL/pocillo de 1 MH ₂ SO ₄(solución de parada). La absorbancia se midió en un lector de microplacas (Thermo Multiscan FC ELISA) a 450 nm.

El título de anticuerpos se determinó como el inverso de la última dilución que se consideró positiva, con un valor de corte definido como absorbancia a 450 nm de 0,20, que era el doble que el de un conjunto de sueros de ratones normales (de 30 ratones no inmunizados). animales). La significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Student, utilizando una transformación logarítmica de los títulos de ELISA. Las diferencias se consideraron significativas si p < 0,05.

Ensayo de neutralización de lentivirus pseudotipado

El lentivirus SARS-CoV-2 S-Pseudotyped ^27 , 46 se produjo mediante la cotransfección de células HEK-293T con plásmidos que portan un gen informador GFP (pLB fue un obsequio de Stephan Kissler, Addgene plásmido n.º 11619; http://n2t. net/addgene:11619 ; RRID:Addgene_11619), una columna vertebral de lentivirus (VRC5602, NIH) y la proteína Spike (VRC7475_2019-nCoV-S-WT, NIH). Brevemente, las células HEK-293T (2 × 10 ⁷) se sembraron en una placa de cultivo de tejidos de 150 mm en medio DMEM que contenía FBS al 10 %. Al día siguiente, las células se transfectaron con 10 μg de VRC5602, 5 μg de pLB-GFP y 3 μg de VRC7475_2019-nCoV-S-WT en medio OptiMEM usando PEI en una proporción de ADN:PEI de 1:3. Veinticuatro horas más tarde, la eficacia de la transfección, indicada como fluorescencia GFP, se comprobó bajo un microscopio fluorescente. Los sobrenadantes de lentivirus pseudotipados se recolectaron 48 h después de la transfección y se almacenaron a 4 ° C, se agregaron medios frescos (DMEM + 5% FBS) a las placas. Después de 48 h, los sobrenadantes combinados se clarificaron mediante centrifugación durante 10 min a 3000 rpm para sedimentar las células residuales. El sobrenadante clarificado se centrifugó durante 5 ha 10.000 rpm. El sedimento se resuspendió en un medio de almacenamiento (OptiMEM + 6 % de sacarosa) y las alícuotas se congelaron a -80 °C hasta su uso.

Los títulos de lentivirus pseudotipados se midieron transduciendo células HEK-293T sembradas previamente en placas de 96 pocillos (2 × 10 ⁴ células/pocillo) y transfectadas transitoriamente con 100 ng de ACE2 (NIH) y 10 ng de proteasa TMPRSS2 (NIH) por pocillo. El stock de virus pseudotipado (sobrenadante concentrado) se diluyó en serie en medio de ensayo (DMEM + FBS al 2,5 %), se incubó durante 2 horas a 37 °C y se añadió a las células transfectadas. Los títulos de virus se calcularon contando las células positivas de GFP utilizando una herramienta de recuento automatizada en ImageJ (NIH), se utilizó un título de 200–225 células positivas de GFP/campo con un aumento de 100x para el ensayo.

Los ensayos de neutralización se realizaron en células HEK-293T transfectadas transitoriamente 24 h antes de la transducción con genes de proteasa ACE2 y TMPRSS2. Cincuenta microlitros de suero inactivado por calor diluido cinco veces en serie (56 °C durante 45 min), dilución inicial de 1:100, se prepararon en medio de ensayo y se incubaron durante 2 h con un volumen igual de lentivirus pseudotipado titulado. Luego se agregaron mezclas de dilución de pseudovirus y sueros (100 μL) en placas de 96 pocillos que contenían 2 × 10 ⁴células/pocillo. La infectividad del pseudovirus se calificó 48 h más tarde y las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio invertido (IX-71 OLYMPUS) y se analizaron con el software de microscopía de código abierto Micro-Manager. Los títulos de neutralización de anticuerpos en suero se calcularon mediante un ajuste de curva de regresión no lineal utilizando el software GraphPad Prism Inc. (La Jolla, CA, EE. UU.). La mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC ₅₀ ), correspondiente a la dilución del anticuerpo sérico que causa una reducción del 50 % de las células positivas para GFP en comparación con las células tratadas con el control «solo con virus», se determinó utilizando el mismo software según Ferrara y Temperton ⁴⁷ .

Aprobación ética

Todos los protocolos experimentales fueron realizados por expertos del Servicio Técnico de Alto Nivel del Consejo Nacional de Investigaciones (CONICET, Argentina) (STAN #4482), bajo lineamientos ISO9001. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL). El estudio se llevó a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE.

ID de acceso de UniProt : UniProtKB-P0DTC2 (SPIKE_SARS2); Spike glicoproteína de SARS-CoV-2. UniProtKB-Q2YKV1 (RISB2_BRUA2); 6,7-dimetil-8-ribityllumazine sintasa 2. UniProtKB-Q9BYF1 (ACE2_HUMAN); enzima convertidora de angiotensina humana 2.

ACE2:

Enzima convertidora de angiotensina 2

SVB:

Lumazina sintasa de Brucella abortus

CD:

Dicroísmo circular

CoV:

Coronavirus

EDTA:

Ácido etilendiaminotetraacético

ELISA:

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

ESI–MS:

Espectrometría de masas de ionización por electrospray

GFP:

Proteína fluorescente verde

HM:

Alta multiplicidad

HPLC:

Cromatografía líquida de alta resolución

IPTG:

Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido, Isopropil β-D-tiogalactosido

LM:

Baja multiplicidad

LPS:

lipopolisacárido

LS:

lumazina sintasa

NTA-Ni2+:

Resina de afinidad con ácido nitrilotriacético cargada con níquel

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

AP:

Banco de datos de proteínas

PEI:

Polietilenimina

RBD:

Dominio de unión al receptor

RBD-BLS:

La partícula multimérica constituida por RBD acoplado covalentemente al decámero BLS

RBD-TMR:

RBD acoplado covalentemente a tetrametilrodamina

SARS-CoV-1:

síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 1

SARS-CoV-2:

síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2

PÁGINA SDS:

Electroforesis en gel de poliacrilamida

SEGUNDO:

Cromatografía de exclusión por tamaño

VET:

Proteasa del virus del grabado del tabaco

RTM:

tetrametilrodamina

ATF:

Ácido trifluoroacético

PÁGINA SDS:

Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS

Agradecemos a LANAIS-PRO-EM por el apoyo con el análisis de espectrometría de masas de proteínas y péptidos, ya la Fundación Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires por su ayuda. También nos gustaría agradecer al Dr. Fernando Goldbaum, Dra. Vanesa Zylberman y al Dr. Santiago Sosa por brindarnos una variante de BLS y una discusión útil sobre el uso de BLS. Agradecemos al Dr. José María Delfino por facilitarnos un dispositivo de microdiálisis para experimentos exploratorios. Agradecemos a Erik Procko por brindarnos pcDNA3-sACE2(WT)-8his (plásmido de Addgene n.° 149268), a Stephan Kissler por brindarnos pLB (plásmido de Addgene n.° 11619) y a David Liu por brindarnos Sortase A pentamutant (plásmido de Addgene n.° 75144).

Este estudio fue apoyado por la Agencia Nacional de Promoción de la Investigación, el Desarrollo Tecnológico y la Innovación (ANPCyT) (IP-COVID-19-234), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Universidad de Buenos Aires (UBA) , PIDAE 2019) y Universidad Nacional de San Martín (UNSAM). Agradecemos a las siguientes Instituciones por apoyar a MF Pavan y NBF (CONICET), TIH (ANPCyT) y MF Pignataro (FARA).

1. Una lista de autores y sus afiliaciones aparece al final del documento.

afiliaciones

1. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Godoy Cruz 2290, C1425FQB, Buenos Aires, Argentina

   Paula M. Berguer, Matías Blaustein, Cecilia D’Alessio, Natalia B. Fernández, Gustavo E. Gudesblat, María G. Herrera, Lorena I. Ibañez, Alejandro D. Nadra, Carlos H. Paván, María F. Pavan, Natalia Rubinstein y javier santos

2. Fundación Instituto Leloir, IIBBA, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires, Argentina

   Paula M Berguer

3. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Instituto de Biociencias, Biotecnología y Biología Traslacional (iB3), Universidad de Buenos Aires, Intendente Güiraldes 2160, Ciudad Universitaria, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina

   Matías Blaustein, Cecilia D’Alessio, Natalia B. Fernández, Hernán G. Gentili, Yamila B. Gándola, Javier Gasulla, Gustavo E. Gudesblat, María G. Herrera, Tommy Idrovo-Hidalgo, Alejandro D. Nadra, María F. Pignataro , Natalia Rubinstein y Javier Santos

4. Departamento de Fisiología y Biología Molecular y Celular, Universidad de Buenos Aires Facultad de Ciencias Exactas y Naturales-Universidad de Buenos Aires, Intendente Güiraldes 2160, Ciudad Universitaria, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina

   Matías Blaustein, Cecilia D’Alessio, Natalia B. Fernández, Hernán G. Gentili, Yamila B. Gándola, Javier Gasulla, Gustavo E. Gudesblat, María G. Herrera, Tommy Idrovo-Hidalgo, Alejandro D. Nadra, María F. Pignataro , Natalia Rubinstein, Javier Santos & Alicia M. Zelada

5. Instituto de Química y Fisicoquímica Biológicas, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956, 1113AAD, Buenos Aires, Argentina

   Luis M. Bredeston y Ernesto A. Román

6. Departamento de Química Biológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina

   Luis M. Bredeston y María F. Pignataro

7. Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Intendente Güiraldes 2160, Ciudad Universitaria, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina

   Patricio O. Craig, Ernesto A. Román, Javier Santos & Diana E. Wetzler

8. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN-CONICET), Buenos Aires, Argentina

   Patricio O. Craig y Diana E. Wetzler

9. Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas-Fundación Pablo Cassará), Saladillo 2468, C1440FFX, Buenos Aires, Argentina

   fernanda elias

10. Laboratorio Pablo Cassará SRL, Buenos Aires, Argentina

    Paola C. Farré

11. Centro de Investigaciones del Medio Ambiente (UNLP-CONICET), La Plata, Buenos Aires, Argentina

    Javier Gasulla

12. Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Instituto de Química Física de los Materiales, Medio Ambiente y Energía (INQUIMAE CONICET), C1428EGA, Buenos Aires, Argentina

    Lorena I. Ibáñez & María F. Pavan

13. Universidad Nacional de San Martín-CONICET, Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIBio), San Martín, Buenos Aires, Argentina

    Diego G. Noseda

14. Instituto de Química y Fisicoquímica Biológicas, LANAIS PROEM, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956, 1113AAD, Buenos Aires, Argentina

    Carlos H. Pavan

15. Departamento de Microbiología, Inmunología, Biotecnología y Genética, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina

    Lucas AM Ruberto

16. CONICET-Universidad de Buenos Aires, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Instituto de Nanobiotecnología (NANOBIOTEC), Buenos Aires, Argentina

    Lucas AM Ruberto

17. Instituto Antártico Argentino, Ministerio de Relaciones Exteriores y Culto, Buenos Aires, Argentina

    Lucas AM Ruberto

18. Instituto de Medicina y Biología Experimental de Cuyo (IMBECU), Centro Científico Tecnológico de Mendoza (CCT-Mendoza), CONICET, Universidad Nacional de Cuyo, 5500, Mendoza, Argentina

    María V. Sánchez

19. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada (IBBEA-UBA-CONICET), Buenos Aires, Argentina

    Alicia M Zelada

consorcios

Contribuciones

Todos los autores del Consorcio AntiCovid Argentino (*) diseñaron experimentos, realizaron investigaciones, analizaron datos y redactaron el manuscrito. Todos los autores (enumerados en orden alfabético) contribuyeron por igual a este trabajo. PCF determinó el contenido de endotoxinas en las muestras de proteínas antes de la formulación para inmunizaciones.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

nota del editor

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